主要内容Contents：一、课程简介核酸的分离与纯化IsolationandPurificationofNucleicAcid二、电泳技术AgaroseGelElrctrophoresisandSDS-PAGE三、聚合酶链式反应技术PolymeraseChainReaction四、DNA序列测定DNASequencing五、分子杂交技术MolecularHybridization－Southern,NorthernandWesternBlot六、基因文库和cDNA文库的构建ConstructionofcDNALibraryandDNALibrary七、外源基因的克隆与表达HeterogenicGeneCloningandExpression八、蛋白质的分离、纯化技术IsolationandPurificationofProtein7外源基因的克隆与表达HeterogenousGeneCloningandExpression基因工程诞生的历史背景:1.核酸是生物遗传物质的实验证据（Avrey,1944）2.DNA结构双螺旋模型(Watson&Crick,1953)3.DNA遗传密码的破译（1961～1966，Nineberg&Crick）4.发现反转录酶(Baltimore&Temin,1970)5.染色体外遗传单位——质粒的深入研究(Lederberg,1950-1970)6.发现DNA限制性内切酶（1968-1970，Arber，Smith和Nathans）7.DNA体外重组（Cohen等，1973）1972PaulBerg&HerbBoyerProducedthefirstrecombinantDNAmolecules.TheySharedthe1980NobelPrizeinChemistry"forhisfundamentalstudiesofthebiochemistryofnucleicacids,withparticularregardtorecombinant-DNA",1973年是基因工程的元年。这座里程碑的树起，凝聚着几代科学家的心血与努力，他们在理论与技术上的卓越贡献，为基因工程的诞生奠定了坚实的基础。一、基因克隆的策略与技术路线克隆外源DNA基本流程图示2.DNA克隆技术涉及的主要过程与方法（1）分离制备待克隆的DNA片段；（2）将靶DNA片段与载体在体外进行连接；（3）重组DNA分子转入宿主细胞；（4）筛选、鉴定和扩增阳性重组子；2.1分离制备待克隆的DNA片段的方法（1）用DNA限制性内切酶切割细胞DNA，然后分离所需要的DNA片段（原核基因）；（2）从细胞中分离所需要的mRNA，通过反转录合成cDNA（真核基因）；（3）用化学法人工合成DNA。2.2靶DNA片段与载体的连接2.2.1载体的选择与改造应具备下几个条件：(1)载体上应具备完成实验目的的最基本元件：如载体上应具有适当的启动子、终止子等。(2)载体上有一些对于它们在宿主中增殖非必需的DNA区域，并包含单个内切酶位点（多克隆位点），以便外源DNA能够通过共价连接插入或取代该区段，形成的重组子可在宿主细胞中复制和增殖。(3)载体分子量不宜过大，以便于DNA体外操作，同时载体DNA与宿主核酸应容易分开，便于提纯。(4)载体应具有筛选标记，以区别阳性重组分子和阴性重组分子。选择标记包括抗药性基因、酶基因、营养缺陷型及形成噬菌斑的能力等。(5)对于表达型载体还应配备与宿主细胞相适应的启动子、信号肽序列、SD顺序、加尾信号、增强子等调控元件。限制性内切酶处理DNA后，一般产生粘性末端、平末端两种形式。两个DNA片段有以下几种出现方式：①两个不同的粘性末端；②两个相同的粘性末端；③一个粘性末端一个平末端；④两个平末端。注意：提高连接效率、降低假阳性！2.3重组DNA分子（重组子）转入宿主细胞宿主细胞是基因克隆载体的增殖场所，对于一个适当的宿主细胞，具有以下几个要求：①对重组子的复制和扩增没有严格的限制；②不存在特异的内切酶体系降解重组子；③在重组子增殖过程中，不对载体DNA进行修饰；④不会产生载体DNA的体内重组；⑤容易导入重组子；⑥符合“重组DNA操作规则”的安全标准。在基因克隆技术中，重组子导入受体细胞有两个概念：转化(transformationorintroduction)：特指以质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。转染(transfection)：是指噬菌体、病毒或以它作为载体构建的重组子导入细胞的过程。高效率感受态细胞的制备（氯化钙转化法）:操作步骤(protocol)：(1)将宿主菌在琼脂培养基平板上划线，37℃培养16—20小时。