绿色荧光蛋白标记基因体内示踪骨髓间充质干细胞的分化（完整版）实用资料(可以直接使用，可编辑完整版实用资料，欢迎下载）・组织工程・绿色荧光蛋白标记基因体内示踪骨髓间充质干细胞的分化胡运生1马保安1李文海2张勇1范清宇1【摘要】目的利用绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP标记技术,观察组织工程骨在体内形成过程中种子细胞的变化与转归。方法Adeno2XTM2GFP扩增和纯化后,测定病毒滴度,感染新西兰大白兔骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs,倒置相差显微镜观察细胞形态变化,并在荧光显微镜下观察GFP表达情况。确认标记成功后,将其与未标记的兔MSCs共同成骨诱导培养3周后,接种于磷酸钙骨水泥(calciumphosphatecement,CPC2纤维蛋白胶(fibringlue,FG复合支架材料,构建组织工程骨作为实验组,回植于供体兔皮下。单纯CPC2FG复合支架材料植入对称部位作为对照。术后1、2、3周行碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP活性测定;4周,激光共聚焦显微镜下对GFP进行示踪观察和型胶原、骨钙素(osteocalcin,OC免疫组织化学检测成骨细胞功能蛋白,Masson染色观察新骨形成。结果Adeno2XTM2GFP经扩增和纯化后,病毒噬菌斑形成,测得病毒滴度为3×108pfuml。Adeno2XTM2GFP感染MSCs后96h,可见GFP表达,感染率达50%~70%,细胞分裂增殖基本正常。术后1、2、3周,实验组ALP活性差异有统计学意义(P<0105。4周,实验组大体可见组织工程新骨形成,对照组未见新骨形成;组织学显示实验组新生骨小梁围绕材料孔隙形成,CPC2FG复合支架材料部分降解;实验组型胶原、OC免疫组织化学结果阳性,对照组未见阳性染色;实验组可见新生组织内有GFP标记的细胞。结论组织工程骨组织结构与松质骨小梁类似,新生组织表达GFP,提示组织工程骨组织的形成来源于接种的细胞。【关键词】组织工程骨骨髓间充质干细胞腺病毒载体绿色荧光蛋白兔中图分类号:R318108Q813111文献标识码:AGREENFLUORESCENTPROTEINLABELINGGENETRANSFERREDINTOMESENCHYMALSTEMCELLSTOTRACETHEIRDIFFERENTIATIONINVIVOHUYunsheng,MABaoan,LIWenhai,etal.CenterofOrthopedicSurgery,OrthopedicOncologyInstituteofPLA,TangduHospitalofFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’anCorrespondingauthor:FANQingyu,E2mail:bonetm@fmmu.edu【Abstract】ObjectiveToobservethetissueengineeredbonefabricatedwiththeculturedmesenchymalstemcells(MSCsbythegreenfluorescentprotein(GFPgenetransfer.MethodsTherecombinantAdeno2XTM2GFPexpressionvectorwaspurifiedafterbeingpackedandproliferatedbytheHEK293cells,andthenitwasusedtoinfecttherabbit’sMSCsdirectlyafterthevirustiterwasassayed.Thecellmorphologicalchangeswereobservedundertheinvertedphasecontrastmicroscope,andtheexpressionofGFPwasobservedunderthefluorescencemicroscopetoconfirmsuccessofthelabelingofMSCs.TheGPF2labeledMSCsandthepureMSCswereculturedtogetherintheconventionalosteogenicsupplementsfor3weeks,andthentheywereseededontothecompoundscaffoldofthecalciumphosphatecement(CPCandthefibringlue(FGtoformanewkindofthetissueengineeredbone.Itwasimplantedintothe