质粒(plasmid)载体的选择标准质粒的复制型实验目的质粒DNA的分离和纯化提纯的思路碱裂解法抽提质粒实验原理手工碱裂解法抽提质粒☆原理示意图平衡酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）作用：氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离。平衡酚pH7.8（酸性下DNA分配于有机相，酚的密度大），可使DNA在上清中。异戊醇有助于消除抽提过程中出现的泡沫。无水乙醇：除去DNA水化层，使DNA沉淀TE缓冲液：溶解DNA碱裂解法流程图平衡液BLSTE缓冲液（溶液P1）LysisBuffer（溶液P2）3MNaAc，pH4.8（溶液P3）去蛋白液PD漂洗液PW洗脱缓冲液EB离心吸附柱废液收集管RNaseA（10mg/ml）使用本试剂盒之前，先在溶液P1中加入RNaseA。溶液P1使用完毕后，请立即至于4℃保存。2.漂洗液PW在第一次使用前需加入无水乙醇，15ml的漂洗液中需加入60ml的无水乙醇，混匀后方可使用。3.使用前先检查平衡液BL、溶液P2和P3是否出现浑浊，如有浑浊现象，可在37℃水浴中加热几分钟，即可恢复澄清。实验仪器与材料实验步骤3.收集菌体：取1.4ml菌液转入小离心管中↓10000rpm，1min弃上清。将离心管倒置于纸巾上，以尽量去除上清。4.悬浮：加250ul溶液P1于细菌沉淀中，涡旋震荡（或用加样枪吹打），彻底悬浮细菌沉淀。（注：一定要彻底悬浮，否则抽提质粒DNA的纯度及得率会大大降低）。↓5.裂解：加250ul溶液P2，立即轻柔颠倒离心管6-8次,（此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏）。(注意：此步需轻柔混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组片断。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。)↓6.中和：加350ul溶液P3，立即温和颠倒离心管6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。（注：此时质粒DNA复性，染色体DNA与蛋白质-SDS复合物沉淀）。↓10000rpm,10min7.转移上清：将上清吸入另一支干净的离心管中（注意尽量不要吸出沉淀）↓10000rpm,10min8.再次转移上清：小心地将上清用加样枪转移到吸附柱中（注意尽量不要吸出沉淀），室温放置1-2分钟↓10000rpm,1min，弃废液9.去蛋白：加入500ul去蛋白液PD于吸附柱中↓10000rpm,1min，弃废液10.漂洗DNA：加入700ul漂洗液PW于吸附柱中↓10000rpm,1min，弃废液11.再次漂洗DNA:加入500ul漂洗液PW于吸附柱中↓10000rpm,1min，弃废液12.去漂洗液：将空吸附柱重新置于收集管上，10000rpm，2min，以除去吸附柱中残余的漂洗液。↓13.收集质粒：将吸附柱置于一个干净的小离心管上，向吸附膜的中间部位滴加30ul洗脱漂洗液EB，放置2min，10000rpm，2min，离心管中即为收集的质粒溶液，做好标记，低温保存备用。DNA的保存注意：用移液器操作时，每一步都要格外小心，特别是在加入溶液II和III后，一定不要剧烈振荡，以免切碎DNA(包括质粒DNA和基因组DNA)！！！离心的注意事项