浙江大学细胞培养-基本技术1、细胞培养技术1.1细胞的原代培养意义掌握无菌操作技术了解小鼠解剖操作技术了解原代细胞培养的一般方法与步骤了解培养细胞的消化分散了解倒置显微镜的使用实验材料原代细胞培养方法大家应该也有点累了，稍作休息贴块法分次消化外植块培养步骤图解操作步骤1---取材操作步骤2---切割胰酶消化法操作步骤---消化、接种培养胰酶消化法操作步骤---消化、接种培养组织块直接培养法操作步骤原代细胞培养结果1.2传代细胞培养细胞传代方法消化法传代培养步骤选取生长良好的细胞，在超净工作台的酒精灯旁，倒去瓶中的旧培养液，加入2-3ml的D-Hanks液，轻轻振荡漂洗细胞，以除去悬浮在细胞表面的碎片(思考：还有什么作用？）加入适量0.1-0.25％胰蛋白酶消化液，室温消化，倒置显微镜下观察，待细胞单层收缩突起出现空隙时，倒去酶液用Hanks液洗涤1次，加入适量培养液，反复吹打细胞，使其成细胞悬液。以1:2或1:3进行分装，并在培养瓶上做好标记，注明代号、日期，轻轻摇匀，37℃CO2培养箱培养。观察：细胞培养24h后，即可观察培养液的颜色及细胞的生长情况。传代细胞培养结果取生长良好的细胞，在超净工作台用无菌吸管把培养瓶中的细胞吹打均匀。转移到无菌的离心管中，盖紧胶盖，平衡后离心（1000rpm/min）5min。(区别贴壁传代)在超净工作台中吸去上清液，加入适量新培养液，用吸管吹打细胞，制成悬液。以1:2或1:3进行分装，并在培养瓶上做好标记，注明代号、日期，轻轻摇匀，37℃CO2培养箱培养。观察：细胞培养24h后，即可进行观察。要预先与临床外科医生和护士商量，并做好一切必要的准备工作。争取拿到的标本新鲜、无菌、少坏死等。联系好手术时间后，立即做好如下准备工作：准备1-2个贮有培养液和抗生素的标本收集瓶，将盖盖紧，保持无菌，瓶外贴上标签，写上工作人员名字、地点和电话号码；将收集瓶送往医院，并与医生和护士讲清取手术标本的部位及注意事项。标本放入收集瓶后，送出手术间，立即送往组织培养实验室。工作人员最好是等在手术间外。但有时手术时间难以掌握。则请护士将收集材料的瓶子盖好后，放入4℃冰箱，尽快打电话通知工作人员。取临床标本时，虽然尽可能做到无菌操作，但仍有污染可能性的存在。可选用抗生素类控制污染。如手术标本比较大（约200mg以上），可将其浸于70%酒精中约30-60秒，这样会减少表面污染而不损坏内部组织的结构和存活。不要用纱布包裹标本，纱布纤维易粘附在组织上。整个取材过程中，都要注意保持组织的湿润，随时给组织块滴加一些培养液或平衡盐溶液。一般情况下，最好是使用冰冷的液体。在剪碎或切割组织块时，尽量使用锋利的刀剪，防止以钝器对组织揉、捻、撕拉等而造成细胞损伤。整个取材过程耗时越短越好。在万不得已的情况下，取材后也可将组织贮存在冷的(4℃)含平衡盐溶液(或其它缓冲盐溶液)的营养液中，最好不超过24-48h(视不同组织类型而定)。1.4培养细胞生长测定细胞计数细胞计数细胞计数由于死细胞的细胞膜通透性发生改变，某些染料可大量进入却不被排出，因而细胞呈色。而活细胞反之，能排出进入细胞内的染料，因而不易着色。此法的原理即是利用死、活细胞对染料的不同反应而区分开两种细胞。台盼蓝染细胞时，时间不宜过长（约2min）。①将1滴细胞悬液(贴壁细胞可经0.25％胰蛋白酶溶液消化后，吹打制成细胞悬液)与2滴台盼蓝液混合后，滴入细胞计数板。②2min后，在显微镜下计数至少200个细胞。未着色的为活细胞，呈蓝色的为死细胞。计算活细胞百分比。细胞生长曲线的绘制1)培养细胞首先在2４孔培养板内分别接种相同数量的细胞。计数并记录接种的细胞悬液之密度。接种时间记为0h。2)计数细胞密度从接种时间算起，每隔24h计数３孔内的细胞密度，算出平均值。为提高准确率，对每孔细胞可计数2-3次。如此操作至第七天结束。四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝四唑盐比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比，用酶标仪测定OD570nm值。MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性实验等。操作步骤1.5细胞冻存和复苏细胞冻存(cryopreservation)：将体外培养物悬浮在冷冻保护剂的溶液中，以一定的降温速率降至零下某一温度(<-70℃)，并在此温度下对其长期保存的过程。复苏(thawing)：以一定的复温速率将冻存的培养物恢复到常温的过程。影响冷冻效果的因素影响冷冻效果的因素4.冷冻保护剂可以保护细胞免受冷冻损伤的物质。渗透性：甘