肿瘤细胞培养中常用技术内容提要：1.肿瘤发生中的细胞生物学机制2.体外培养肿瘤细胞特点3.肿瘤细胞培养中常用技术①抗癌药物敏感性试验②肿瘤细胞转移体外模型的建立细胞凋亡细胞增殖失控与端粒酶细胞分化侵袭与转移抑癌基因失活原癌基因激活二、肿瘤体外培养细胞优点：1.免受机体内部因素影响2.可长期保存3.快速筛选抗癌药4.费用低缺点：与体内环境有差异，应结合体内试验肿瘤细胞取材及培养一般取自患者。实体瘤：原发癌组织或转移灶胸、腹腔炎：胸水或腹水白血病：血液或骨髓液注：取材后及时培养勿放置过久常用的肿瘤细胞系1.www.atcc.org2.http://www.181817.com/181817_Category_2073020_1.html（美国ATCC细胞库中国代理）3.http://www.ctcccas.ac.cn/xibao/catalogue.html4.http://www.docin.com/p-19978954.html三、肿瘤细胞培养中常用技术1.抗癌药物敏感性试验2.肿瘤细胞转移体外模型的建立1.抗癌药物敏感性试验美蓝法染料排斥法生长曲线测定法集落形成试验法MTT比色法裸鼠成瘤实验法美蓝法原理：利用活细胞的脱氢酶提供氢离子，使甲烯蓝（美蓝）还原为甲烯白（无色），细胞死亡之后，脱氢酶失活，无法使甲烯蓝还原，因此被染成蓝色，检测用药后的死细胞数能反映药物的抑瘤作用。缺点：假阳性率高台盼蓝排斥试验原理：台盼蓝能使死细胞着色（淡蓝色），而活细胞拒染。活细胞总数×100活细胞率（％）＝活细胞总数＋死细胞总数注意：简单，最常用。染色时间不宜过长生长曲线测定法原理：癌细胞在最适条件下呈指数生长，当细胞处于对数生长期时用于试验，以细胞数的对数与培养时间可得一条生长曲线，比较加药组合对照组细胞生长曲线，可反映出药物对肿瘤细胞生长的影响。集落形成试验法原理：肿瘤细胞系由不同比例增殖及分化能力不同的细胞组成，其中含有极少部分具有自我复制和增值能力的干细胞，具有分化和形成集落的特性，约占1%，其与肿瘤治愈、复发或转移密切相关。因其具有分化及形成集落的能力，故用集落法可体外检测抗癌药物敏感性。四唑盐（MTT）比色法XTT比色法：与MTT类似，但产生的橙黄色甲儹（formazan）溶于水。缺点：水溶液不稳定，需低温保存或现用现配。CCK-8比色法：1.产生的formazan都是水溶性，检测灵敏度更高。2.更加稳定，酚红和血清对其测定无明显影响对细胞无明显毒性，3.加入显色后，可以在不同时间反复用酶标仪读板，使检测时间更加灵活，便于找到最佳测定时间放射性同位素掺入法危险性大，少用裸鼠成瘤实验法（详见下章）应用：1.体外瘤培养细胞株的鉴定2.研究肿瘤在体内的生物学行为3.药物作用机理研究2.肿瘤细胞转移体外模型的建立模型主要包括：1）细胞体外黏附实验2）肿瘤细胞迁移实验3）肿瘤细胞侵袭实验4）肿瘤转移试验1）细胞体外黏附实验（1）肿瘤细胞在细胞外基质上黏附的测定原理：高侵袭的肿瘤细胞与基底膜成分的异质性黏附能力通常增高，而肿瘤细胞间的同质性黏附能力则会下降。此特性有利于肿瘤细胞与肿瘤母体的分离，并侵犯基底膜等正常组织。主要试剂：人工重构基底膜材料Matrigel（主要成分为层粘蛋白和IV型胶原蛋白）、纤维连接蛋白（FN）、小牛血清白蛋白（BSA）、MTT。方法步骤：1）包被基底膜2）水化基底膜3）接种并培养细胞4）MTT检测黏附率（%）=[（实验组细胞A值/BSA组细胞A值）-1]×100（2）肿瘤细胞与内皮细胞黏附测定肿瘤细胞与脉管内皮细胞的黏附有利于其在脉管壁着床。原理：利用肿瘤细胞对活性染料RoseBengal的摄取量来检测肿瘤细胞与内皮细胞的黏附反应。体外培养细胞摄取RoseBengal后，整个胞浆被染红，肿瘤细胞数越多，摄取的染料越多，吸光度A值越大。内皮细胞对染料摄取少且稳定，A值基本不变。方法:96孔板底层铺单层胎儿脐静脉内皮细胞，上层铺肿瘤细胞，染色后，用ELISA仪测A值。A值=内皮细胞和肿瘤细胞A值-内皮细胞A值2）肿瘤细胞迁移实验（1）创伤实验模型本法借鉴体外细胞致伤愈合实验模型，测定肿瘤细胞在细胞外基质上的运动特性。主要试剂：人工重构基底膜材料Matrigel（主要成分为层粘蛋白和IV型胶原蛋白）、纤维连接蛋白（FN）、小牛血清白蛋白（BSA）。方法步骤：1）包被基底膜2）水化基底膜3）接种并培养细胞4）人工划痕并测定原始距离（加入药物）5）测量迁移距离：根据原始距离计算细胞实际