试验一RNAisoReagent是一种快速方便的总RNA提取试剂，可以从动物组织、植物材料、各种微生物、培养细胞等中提取总RNA。样品在RNAisoReagent中能够充分被裂解，在加入氯仿离心后，溶液会形成上清层、中间层和有机层（下层)，RNA分布在上清层中，收集上清层后，经异丙醇沉淀便可以回收得到总RNA。【RNA提取实验前的准备】RNA制备的关键是要抑制细胞中的RNA分解酶和防止所用器具及试剂中的RNA分解酶的污染。因此，在实验中必须采取以下措施：戴一次性干净手套；使用RNA操作专用实验台；在操作过程中避免讲话等等。通过以上办法可以防止实验者的汗液、唾液中的RNA分解酶的污染。【试剂配制】用于RNA实验的试剂，须使用干热灭菌（180℃，60分钟）或使用上述方法进行DEPC水处理灭菌后的玻璃容器盛装（也可以使用RNA实验用的一次性塑料容器)，使用的无菌水须用0.1%的DEPC处理后再进行高温高压灭菌。RNA实验用的试剂和无菌水都应专用，避免混用后交叉污染【使用器具】尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在使用前按下列方法进行处理。(1）用0.1%DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在37℃下处理12小时。(2）然后在120℃下高压灭菌30分钟以除去残留的DEPC。RNA实验用的器具建议专门使用，不要用于其他实验。RNA提取操作流程试验二PCR原理PCR（PolymeraseChainReaction；聚合酶链式反应）是一种体外扩增DNA的简单而有效的方法。虽然原理上PCR法是扩增DNA，RNA不能直接被扩增，但是经过反转录酶的作用把RNA反转录成cDNA后，PCR法便可应用于RNA的解析了。迄今为止，此方法已广泛应用于RNA的构造解析、cDNA的克隆及RNA水平上的表达解析等多种领域。RNAPCR(RT-PCR)的原理PCR引物的设计原则：PCR扩增仪器RT反应1.按下列组成配制反转录反应液PCR反应1.按下列组成配制PCR反应液。2.把1.的反应液加入到A-2.反转录结束后的PCR反应中，轻轻混匀。3.按以下条件进行PCR反应*6。DNAMarker50×TAEBuffer(pH8.5)组份浓度2MTris-醋酸,100mMEDTA配制量1L配制方法1.称量下列试剂，置于1L烧杯中。2.向烧杯中加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解。3.加入57.1ml的醋酸，充分搅拌。4.加去离子水将溶液定容至1L后，室温保存。配制方法1.配制适量的电泳及制胶用的缓冲液（通常是0.5×TBE或1×TAE)。2.根椐制胶量及凝胶浓度，准确称量琼脂糖粉，加入适当的锥形瓶中。3.加入一定量的电泳缓冲液（总液体量不宜超过锥形瓶的50%容量)。注：用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须统一。4.在锥形瓶的瓶口上盖上保鲜膜，并在膜上扎些小孔，然后在微波炉中加热溶解琼脂糖。加热时,当溶液沸腾后，请戴上防热手套，小心摇动锥形瓶，使琼脂糖充分均匀溶解。此操作重复数次，直至琼脂糖完全溶解。必须注意，在微波炉中加热时间不宜过长，每次当溶液起泡沸腾时停止加热，否则会引起溶液过热暴沸，造成琼脂糖凝胶浓度不准，也会损坏微波炉。溶解琼脂糖时，必须保证琼脂糖充分完全溶解，否则，会造成电泳图像模糊不清。5.使溶液冷却至60℃左右6.将琼脂糖溶液倒入制胶模中，然后在适当位置处插上梳子。凝胶厚度一般在3~5mm之间。7.在室温下使胶凝固（大约30分钟~1小时)，然后放置于电泳槽中进行电泳。8.加入溴乙锭溶液（终浓度0.5mg/ml),并充分混匀。注：溴乙锭是一种致癌物质。使用含有溴乙锭的溶液时，请戴好手套。注：凝胶不立即使用时，请用保鲜膜将凝胶包好后在4℃下保存，一般可保存2～5天。