SOD酶的提取与纯化设计方案一、设计背景SOD酶又称为超氧化物歧化酶，是中国卫生部国家批准的五种具有抗衰老、免疫功能调节、调节和降血脂、抗辐射、美容护理功能的重要物质之一。其主要的作用功能有：增强人体的免疫力、提高睡眠质量，提高记忆力、防止衰老。合理软化血管、血脂，血压、胆固醇、血液粘稠度、防止阿尔茨海默症，提高肝胆作用，防止老年白内障，改善视力，对糖尿病患者有明显的修复功效，可以预防前列腺炎，美白，去斑，去皱，增强创伤愈合能力等。目前所发现的SOD酶活性主要是存在于各种生物体内，一般从各种生物体内进行提取分离纯化获得，其中主要包括微生物、虫类、水生类、植物体和哺乳动物等其他生物体。到目前为止，制备出的SOD酶主要是以动物血为天然原料通过分离提取纯化等方法获得，但是这些提取方法容易受到原料的来源、产量的高低、产品质量是否稳定及安全有效等制约的严重影响，然而用各种微生物血液为原料分离提取SOD酶，获得原料价格便宜且容易得到，可以进行规模性开发生产，吸收利用率最大化。生物利用度高等优点。二、设计依据SOD酶广泛分布于各种生物体内，如哺乳动植物和其他微生物等。如果运用技术把sod酶提取纯化,并运用它的性质应用在药物，美妆看氧化，防晒等方面，那这将会是人类的一大福利。就目前为止，我国在提取纯化sod酶的技术比国外相对慢一步。从90年代才开始发展，就目前为止，其提取纯化sod酶的的主要原材料有猪血、玉米、大蒜、花生种子、蔬菜、刺梨、茶叶、等。大豆是我国主要的农作物之一，种植基地多而面积广大，产量高，可以说是资源丰富且此农产品价格也同样的低廉。不仅如此，大豆中所含的维生素C和维生素E以及SOD酶的微量元素平均含量比一般的藤本植物高。而且，相对比于哺乳动物和其他微生物来说，植物不仅易于长期接受各种自身免疫抗体病毒和其他免疫细菌的直接接触感染，具有很大的实用价值和发展潜力。三、设计方案（一）试剂与设备1.试剂配制pH7.8，10mmol/L磷酸缓冲液(内含有2mmol/LEDTA乙二胺四乙酸)；20mmol/LHCl溶液；考马斯亮蓝溶液：100mg考马斯亮蓝溶液G-250在100ml95%乙醇溶液中，摇晃，等待乙醇溶解之后，再加入200ml85%的浓磷酸，一直反复摇晃晃动后再加入少量的蒸馏水后定容至1000ml,过滤待用。pH8.2的50mmol/LTris-HCl缓冲液(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐）；样品称取pH8.250mmol/LTris-HCl(:三羟甲基氨基甲烷盐酸盐）Tris1.5g,EDTA-2Na(乙二胺四乙酸二钠)0.5g用一个双蒸水控制溶解至160ml，并且用HCl溶液作为调节剂调节PH至8.20，之后再定容至100ml为之。100mmol/L邻苯三酚溶：100mmol/L邻苯三酚:称取邻苯三酚0.15g，用10mmol/LHCl溶液使其溶解，定容至20ml,并且避光保存。2.设备高速组织搅碎机，高速冷冻离心机，层析柱(1×40CM)，自动部分收集器，恒流泵，进样器，微量进样器，紫外分光光度计，支架，烧杯，玻璃杯，胶头滴管。（二）层析柱装填1.填料预处理量取SephadexG-75干凝胶2g，加入适量洗脱液沸水浴使其溶胀2个小时，大约30-40分钟左右的时间利用倾斜法起除掉溶液表面悬浮的杂质，并且大约在10℃-30℃的条件下储存在磷酸缓冲液中。层析柱检查通透性，若有异物，用酸性溶液试剂清洗后用大量清水冲洗把水滴干待用。2.大豆提取处理称取大豆种子20g在2-10℃条件下浸泡24h，沥干水分，再加入放在冰冻条件下保存的PH7.810mmol/L磷酸缓冲液60g，最后用高速组织搅碎机把经处理过的大豆种子打碎。之后用高速离心机以8000rpm离心去除掉多余的大颗粒，离心5-6次，每一次10min)最后收取上清液，即SOD酶，待用。3.填料上层析柱首先将层析柱竖直固定在支架上，并连接好恒流泵，部分收集器，然后调节洗脱液的调节压60cm。其次先先层析柱中加入1/3高度的PH7.810mmol/L磷酸缓冲液，之后用玻璃棒帮助使其准备好的凝胶溶液缓缓注入缓冲液内，并让其自然沉降，沉降好的柱床为总柱床的2/3为宜，如果第一次倒入的高度没有达到2/3处，可以先打开阀门，放入部分的缓冲液，同时用玻璃棒搅起管中的凝胶界面，然后继续向层析柱中注入凝胶，一直达到想要的高度为止，此过程一定要缓慢，平稳。之后待上述步骤完成之后，再用3-4个床体积的洗脱液进行洗脱，使其床柱稳定，如果一直不稳定，可多进行几次洗脱步骤。4.平衡液处理首先打开层析柱阀门放去床表面上的缓冲液一直到凝胶界面重合为止，之后关