印染(2002No.8)www.cdfn.com.cn测试与标准纤维素酶活力测定方法张瑞萍南通工学院(226007)摘要用DNS为显色剂,分别以滤纸和CMC为底物,以滤纸糖酶活性(FPA)和羧甲基纤维素酶活性(CMCase)表征纤维素酶活力。确定酶活测定用波长为530nm,参比溶液应为失活酶、底物和DNS等共热的反应物;比较了两种底物的酶活力测定方法。结果表明,CMCase比FPA高,说明酶对水溶性底物有较高的活力,也表明吸附对酶的活性部位与纤维素分子链段的结合及催化均有很大影响;对于不同牌号的纤维素酶,织物的酶减量率与CMC酶活力关系密切。叙词:测试纤维素酶活度中图分类号:TS197纤维素酶是多组分复合物,各组分的底物专一性不同。纤维素酶作用的底物比较复杂,反应产物不同,致使纤维素酶活力测定方法很多,各国的方法亦不统一。我们选择滤纸、C为底物,原理系利用纤维素酶CM催化水解纤维素,产生纤维多糖、二糖及葡萄糖等还原糖,与显色剂反应,求出还原糖的浓度,间接求出酶的活力。由不同底物测得的酶活力分别称作FPA(滤纸糖酶活力)和CMCase(羧甲基纤维素酶酶活力)。本文分析确定酶活力测定的主要条件,比较两种底物的酶活力测定方法的结果,探讨纤维素酶活力与织物减量率的关系,为酶在生产中的利用提供依据。色化合物,用分光光度计比色,确定低分子糖含量。碱性条件下DNS与还原糖共热反应如下:O2NOHCOOH+还原糖O2NH2NOHCOOHO2N生成的棕红色氨基化合物系比色法测定基础。2.2最大吸收波长的确定选取490580nm波长对显色液进行比色。由图～1可知,不同浓度的葡萄糖溶液在490500nm处有～1实验方法1.1化学药品、材料最大吸收,DNS在此波长下也有较明显的吸收。为了排除DNS的干扰,选择在波长530nm处进行测定,此波长下的葡萄糖吸收虽有所降低,然而符合“吸收最大、干扰最小”的原则。纤维素酶(工业品),DNS试剂(自配),冰醋酸,醋酸钠,葡萄糖(均为分析纯),滤纸(定性),羧甲基纤维素酶CMC(试剂级),纯棉针织物半制品(南通针织厂)。1.2FPA滤纸酶活力和CMC酶活力的测定取适当稀释的酶液,分别以滤纸或1%的CMC溶液为底物,于50℃恒温水解反应1h;然后加入显色剂DNS,沸水浴中煮沸5min;再加入蒸馏水,于530nm测定吸光度OD值。酶活可定义为:每毫升酶液1min产生1mg葡萄糖为一个单位(Λ)。1.3针织物酶减量率的测定2.3底物及酶本身含糖量的影响将酶处理前后的试样在烘箱中105℃烘至恒重。处理前织物干重-处理后织物干重×100%处理前织物干重在实验过程中发现,底物特别是滤纸,也含有一定的还原糖,在碱性的DNS试剂中也会发色。而且,试验所用的纤维素酶是一种工业级的复合酶,品种不同,其本身含糖量也不同。为了排除这类还原糖的干扰,参比溶液取失活后的酶、底物、S等共热的反应物。DN2.4葡萄糖标准曲线用不同浓度的葡萄糖溶液作为标准溶液,与DNS共热反应显色后,测出其吸光度OD值(见图2)。标准曲线的线性相关系数R2为0.9991(见图2),线性相当好,可以用于酶活力的测定。减量率=2结果与讨论2.1显色剂的选择38选用DNS,在碱性条件下与还原糖反应,生成有?1994-2009ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreserved.DNS(黄色)32氨基252硝基水杨酸(棕红色)图1DNS与葡萄糖的吸收曲线http://www.cnki.net纤维素酶活力测定方法印染(2002No.8)=1∶0.87∶0.76),这与不同酶的CMCase酶活比值(杰能科∶NOVOL∶PLUSL=1∶0.79∶0.62)是相近的。图2葡萄糖标准曲线2.5底物的选择对酶活力的影响目前理论认为,大多数由微生物产生的纤维素酶是一个多组分酶系,主要含有三种组分:内切2Β1,42葡2聚糖酶、外切Β1,42葡聚糖酶和Β1,42葡萄糖苷酶。其22中,内切(endo2)酶能进攻纤维素大分子链的中间部位,任意地切断大分子,而生成较短的链;而外切(exo2)酶仅从纤维素大分子链的非还原性末端切下一个个纤维二糖;Β2葡萄糖苷酶则把低分子葡聚糖催化分解成葡萄糖。纤维素酶复合体与纤维素纤维作用的最终效果,是由其中各种酶综合作用所决定的。作为底物的滤纸其结构较为松散,可及区较多,非还原性末端也较多,容易同时被内切酶和外切酶降解,再由Β2葡萄糖苷酶分解成葡萄糖等还原糖。用比色法定量测定还原糖的生成量,可反映纤维素酶的总酶活力。由于外切酶对纤维素链专一性高,而内切酶专一性较低,在