实验目录实验一植物基因组DNA提取4.核酸是生物有机体中的重要成分，在生物体中核酸通常与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。核酸分为DNA和RNA，在真核生物中，前者主要存在于细胞核中，后者主要存在于细胞质和核仁里。在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。5.去除蛋白的方法，通常采用SDS/CTAB等去污剂使蛋白变性，与核酸分离，从而从材料中直接提取DNA.6.酚是高效的蛋白质变性剂，氯仿除了进一步去除蛋白，也可以去除残留的酚。本实验是通过SDS法提取拟南芥基因组DNA。SDS是一种阴离子去污剂，能与细胞膜上的蛋白质结合，在65°C高温下能有效裂解细胞膜，使基因组DNA释放出来。在用SDS-苯酚法提取基因组时，酚能够使SDS-蛋白质复合物中的蛋白质变性，从而使蛋白质和水溶性的DNA分离。（此法不适用于提取多糖含量较高的植物基因组DNA提取。）1.掌握植物基因组DNA分离、纯化原理2.通过SDS法提取拟南芥基因组DNA。仪器及耗材：研钵、微量移液器及吸头、EP管、台式离心机。材料：拟南芥小苗试剂：DNAExtractBuffer(0.2MNaCl,25mMEDTA,0.5%SDS,pH7.5);70%乙醇；酚；氯仿；异丙醇;RNase实验步骤核酸—DNA和RNA所含碱基的苯环结构（嘌呤环和嘧啶环）的共轭双键具有紫外吸收的特性，它们在260nm处有最大的吸收峰。因此，可以用260nm波长进行核酸含量测定。波长为260nm时，DNA或RNA的光密度的大小不仅与总含量有关，也与它们的不同构型有关。标样：DNA浓度为1μg/mL时，OD260=0.02当OD260=1时，双链DNA含量约为50μg/mL单链DNA含量约为37μg/mLRNA含量约为40μg/mLDNA浓度(μg/μL)计算：50×OD260读数RNA浓度(μg/μL)计算：40×OD260读数9EDTA的作用：抑制内外源DNase的活力。加螯合剂(EDTA)除去酶的辅因子(Mg2+)，使酶的活性丧失。实验二PCR克隆目的基因PCR原理FLASH演示TaqDNAPolymerase1988年Saiki等从水生嗜热杆菌(thermusaquaticus)中提取耐高温的TaqDNA多聚酶(TaqDNAPolymerase)，此酶在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60%。缺点：TaqDNAPolymerase只有5’→3’聚合酶活性，但没有3’→5’外切活性，无法消除突变和错配，碱基错误掺入率可达10-4/碱基/循环PfuDNAPolymerasePfuDNA聚合酶是已知保真度最高的聚合酶，来自于Pyrococcusfuriosis菌株，不仅具有掺入反应迅速及热稳定性高的优点，更是当前市场上所有DNA聚合酶中掺入出错率最低的一种。优点：Pfu具有3’→5’校阅功能，其错配率分别仅为10-7。缺点：效率低，扩增片段较短TaqPlusDNAPolymerase是Taq和PfuDNA聚合酶的混合物，与TaqDNA聚合酶相比，具有扩增长度增加（简单模板可有效扩增20kb,复杂模板可有效扩增10kb),保真度好的特点；与PfuDNA聚合酶相比，具有扩增速度快，反应效率高的优势。PCR反应体系组成1.模板2.引物引物设计原则4种dNTPMg2+DNA聚合酶DNA聚合酶单位定义：1个酶单位是指在74℃下，30min内，使10nmol的dNTP掺入到核酸中所需的酶。不同公司提供的酶U的定义也不同。反应缓冲液缓冲液10mmol/lTris.Cl提供适合反应的pH值（pH8.4）50mmol/lKCl促进引物退火10µg/ml明胶或血清白蛋白，二硫苏糖醇为Taq酶的保护剂，稳定酶的活性PCR反应主要参数：1.预变性：94°C，3--5min2.变性：94°C，30s-1min3.复性：56°C，20s--2min4.延伸：72°C，30s--3min5.总延伸：72°C，10min预变性和变性退火延伸循环次数1.通过PCR从拟南芥基因组中扩增目的基因片段2.学习PCR仪等仪器的使用材料：拟南芥基因组DNA器材：移液器及吸头，PCR管，PCR仪，台式离心机。所需试剂实验步骤2.将PCR管放置到PCR仪中，盖好盖子3.用94oC预变性3-5分钟；94oC变性1分钟，58oC退火1分钟,72oC延伸2分钟,32个循环；最后一轮循环结束后,于72oC下保温10分钟，4.终止反应，从PCR仪取出PCR管，放置4oC存1.PCR非常灵敏,尽可能避免污染。吸头、离心管应高压灭菌,每次吸头用毕应更换,不要互相污染试剂；2.加试剂前,应短促离心10秒钟,然后再打开管盖,以防手套污染试剂及