酶的催化机制酶催化机理研究的主要方法（2）三维结构的研究酶的三维结构决定了酶的功能，如果得到酶的三维结构信息，对酶的催化机制的研究提供最直接的线索。获得酶三维结构的方法有X射线衍射和NMR。（3）定点突变分子生物学技术的发展使对蛋白质定点突变变的很容易，所以只要得到一个酶的基因，就可以对其氨基酸序列进行任意的突变。如果对一个酶氨基酸残基进行有的放矢的突变，会对酶的作用机制研究提供有价值的信息。把胰蛋白酶活性中心裂缝底部的Asp189突变成不带电荷或带正电荷的氨基酸残基，胰蛋白酶活性完全丧失。胰蛋白酶只水解碱性氨基酸残基与其他氨基酸氨基形成肽键，所以Asp189通过侧链的负电荷与底物上的碱性氨基酸残基带正电荷的侧链结合。（4）动力学分析动力学分析可以为研究酶的作用机制提供有用的数据。（5）化学修饰用双功能试剂对酶的修饰有助于确定在三维结构上相邻的基团。借助底物或竞争性抑制剂的保护，可以通过化学修饰确定活性中心的氨基酸残基的性质。例：假定一个酶分子上有6个Csy残基，但又无法确定它的活性中心是否有或者有几个Csy残基，可以分别在有或无过量底物存在下，用碘代乙酸修饰酶，然后进行对比，在底物保护的情况下，不能被修饰的Csy残基就在活性中心。过渡态稳定学说ΔG活为反应活化能HA-HB-HC为过渡态中间物。过渡态中间物既不是产物，也不是底物，而是介于旧化学键减弱，新化学键开始形成的一种不稳定的结构状态。活化能也不是反应的总自由能变，自由能变与反应平衡时底物浓度和产物浓度有关，而活化能与反应速度有关。活化能越低含有足够能量的反应物分子越多，反应发生的越快。提高温度或其他因素的作用可以促进更多的反应物达到过渡态，提高反应速度。所有的催化剂都是通过降低活化能加快反应速率。酶促反应和非酶促反应过程的自由能变化过渡态稳定的化学机制邻近定向效应广义的酸碱催化广义的酸碱催化和特定的酸碱催化的差别：（1）特定酸碱催化是H+或OH-加速反应，广义的酸碱催化是酶分子上的酸性和碱性基团催化反应。（2）缓冲溶液对他们的影响不同。特定酸碱催化反应速率只取决于pH，与缓冲溶液浓度无关，广义的酸碱催化，缓冲溶液有助于通过提供或夺取质子来稳定过渡态，反应速度取决于底物和酶的质子化状态，还取决于缓冲溶液的浓度。缓冲溶液浓度的升高提高了广义酸碱催化的效率。静电催化溶菌酶Glu35将质子交给糖苷键上的O原子以后，O因此带上正电荷，随后糖苷键断裂，左边的糖基1号位的C原子带上正电荷，邻近的Asp52的羧基本来于解离状态，带负电荷，起着中和正电荷稳定过渡态的作用。溶菌酶的最适pH与Glu35和Asp52的解离状态有关金属催化共价催化几种酶的共价催化Y比X更好的离开基团，X是比Z更好进攻的基团，共价中间物的反应性比底物强。底物形变底物形变溶菌酶也利用这种方式进行催化：与溶菌酶活性中心结合的6碳糖在溶菌酶的诱导下，从椅式构象变成半椅式构象而发生形变，周围的糖苷键更容易发生断裂。几种常见酶的结构与功能蛋白酶所有蛋白酶在催化过程中都经历四面体的过渡态，该过渡态形成的原因是反应涉及一个亲核基团进攻肽键的羰基碳。如果是丝氨酸蛋白酶和巯基蛋白酶，进攻的亲核基团分别是Ser残基的羟基和Cys残基的巯基，否则就是水分子。丝氨酸蛋白酶和巯基蛋白酶的催化机理中包括共价催化，脂酰基酶是酶与底物的共价中间物，而金属蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶催化的反应更为直接，没有共价催化。丝氨酸蛋白酶虽然各种丝氨酸蛋白酶具有高度的同源性，但构成催化三元体的三个氨基酸残基在肽链中的位置并不完全相同。然而，酶学家已达成共识，将这三个氨基酸残基总是进行一样的编号，即His57、Asp102和Ser195。它们在催化中的具体功能是：（1）Ser195充当进攻底物的亲核基团；（2）His57作为广义的酸碱催化剂；（3）Asp102的功能仅仅是定向His57，影响His的pKa，改变其酸碱性质。胰蛋白酶具有很深的底物结合口袋，而口袋的底部又是Asp，特别适合长的碱性氨基酸侧链（Lys赖和Arg精）的结合；胰凝乳蛋白酶的底物结合口袋没有胰蛋白酶深，但比它宽，而且口袋壁分布的是疏水氨基酸，所以特别适合芳香族氨基酸的结合；弹性蛋白酶的底物结合口袋非常浅，最适合结合侧链较小的氨基酸残基。糜蛋白酶的催化经历了酯酰化酶共价中间物，全部反应分五步：3、四面体中间物因肽氧负离子与Ser195以及Gly193之间形成氢键而稳定。4、肽键断裂，离开基团从His57咪唑环上得到一个质子。原来肽键羧基一侧通过氢键以及与Ser195形成共价键仍与酶结合。5、水进入活性中心，质子化His57，使之成为酸。释放出来的OH-亲核进攻留下来的多肽羰基碳，第二个四面体形的过渡态中间物形成。最后Ser