IBVN基因和M基因原核表达及N蛋白间接ELISA方法的初步建立的中期报告本次中期报告介绍了IBV（传染性支气管炎病毒）N基因和M基因在原核表达及N蛋白间接ELISA方法的初步建立情况。一、IBVN基因和M基因原核表达IBVN基因和M基因是IBV病毒感染中最基础的两个基因，对该病毒的研究具有重要意义。为了更好地研究这两个基因，我们尝试利用原核表达系统进行表达，并进一步纯化获得重组蛋白。1.N基因和M基因的原核表达载体构建我们首先将IBVN基因和M基因的全长序列克隆到pET-28a(+)载体（Novagen）上，得到重组质粒pET-28a(+)-N和pET-28a(+)-M。2.菌株的构建与表达条件的优化重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)菌细胞，经过诱导表达后，菌株基本上可以表达目标蛋白。为了优化表达条件，我们对诱导温度、IPTG浓度、细胞密度等因素进行了调整和优化。3.目标蛋白的表达和纯化优化后，我们获得了较高的表达水平和较好的纯化效果：（1）N基因：菌株在37℃，IPTG浓度为0.5mM，细胞密度达到OD600=1.0时诱导表达，于16℃下过夜培养，收集细胞，超声破碎、离心、展开、层析，最终得到目标蛋白。纯化后的产量为0.5mg/L。（2）M基因：菌株在30℃，IPTG浓度为0.5mM，细胞密度达到OD600=0.4时诱导表达，于12℃下过夜培养，收集细胞，超声破碎、离心、展开、层析，最终得到目标蛋白。纯化后的产量为0.3mg/L。二、N蛋白间接ELISA方法建立为了检测IBV感染患者的血清中是否含有抗IBVN蛋白的抗体，我们建立了N蛋白间接ELISA方法。1.ELISA实验基本流程首先将纯化后的N蛋白溶液加入96孔板中并孵育过夜，将板洗涤并加入患者血清样品。加入抗人IgG-HRP二抗和底物后，测定吸光值。2.建立的方法的灵敏度和特异性验证我们使用已知含有抗IBVN蛋白抗体的血清和无含抗体的血清进行了实验，结果表明该方法的灵敏度和特异性均较好，可用于IBV抗体的检测和筛查。综上，我们成功地建立了IBVN基因和M基因原核表达及N蛋白间接ELISA方法，为进一步深入研究IBV的病理机制以及诊断该病毒感染提供了基础支持。