杂交瘤技术【原理】以聚乙二醇（PEG）为细胞融合剂，使免疫后能产生抗体的小鼠脾细胞与能在体外长期繁殖的小鼠骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤细胞，通过次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷（HAT）选择性培养基的作用，只让融合成功的杂交瘤细胞生长，经反复的免疫学检测筛选和单个细胞培养（克隆化），最终获得机能产生所需单克隆抗体又能长期体外繁殖的杂交瘤细胞系。将这种细胞扩大培养，接种于小鼠腹腔，可从小鼠腹水中得到高效价的单克隆抗体。（一）小鼠骨髓瘤细胞理想骨髓瘤细胞的条件：①细胞株稳定，易于传代培养；②细胞株本身不产生免疫球蛋白或细胞因子；③该细胞是HGPRT或TK的缺陷株；④能与B细胞融合成稳定的杂交瘤细胞；⑤融合率高。目前最常用的是NS-1和SP2/O细胞株（二）免疫脾细胞多采用与骨髓瘤细胞同源的纯系BALB/c小鼠；免疫途径多为腹腔内或皮内多点注射法。若抗原微量，可用脾脏内直接注射法进行免疫。细胞性抗原不需加佐剂，可溶性抗原需加完全弗氏佐剂。（三）细胞融合是产生杂交瘤细胞的中心环节。一般用分子量1000D、1500D、4000DPEG作细胞融合剂，浓度30~50%之间，基本方法是将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:2~1:10比例混合，加入PEG，诱导两种细胞融合，时间控制在2min以内，再加入培养液缓慢稀释PEG融合液，直至失去融合作用，融合细胞形成具有两个或多个核的异核体，最终产生杂交细胞。（四）杂交瘤细胞的选择性培养肿瘤细胞合成DNA有两条途径：一条为生物合成途径，可被叶酸拮抗物（氨基蝶呤）阻断；另一条为替代途径，叶酸代谢受阻时，细胞通过HGPRT和TK，利用核苷酸前体物合成核苷酸，进而合成DNA。HAT培养液含三种成分：次黄嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）和胸腺嘧啶核苷（T），经HAT培养液筛选后，只有具备两亲本细胞双重特性的杂交瘤细胞能长期生存并产生抗体，成为制造单克隆抗体的细胞源。细胞类型正常培养细TK缺陷细HGPRT缺陷细杂交瘤细胞胞胞胞正常培养基++++HAT培养+--+基免疫浊度测定：是应用抗原抗体结合在液体中形成的免疫复合物干扰光线可用仪器检测的特点，将现代光学测量仪器与自动分析检测系统相结合应用于沉淀反应，对各种液体介质中的微量抗原、抗体和药物及其他小分子半抗原物质进行定量测定的技术。【原理】可溶性抗原与相应抗体特异性结合，两者在比例合适和增浊剂的作用下，可快速形成一定大小的免疫复合物，使反应也出现浊度。优点：稳定性好、敏感度/精确度高、简便快速、易于自动化【影响因素】1、抗原抗体的比例钩状效应（highdosehookeffect）：免疫浊度测定，抗原过量导致形成的免疫复合物（IC）分子小，发生再解离，浊度下降，光散射减少。2、抗体的质量：特异性强、效价高、亲和力强、R型抗体3、抗原抗体反应的环境：反应液最适pH6.5~8.5，离子强度大（常用磷酸盐缓冲液PBS最为反应液）4、增浊剂：如聚乙二醇PEG、吐温-20【分类】速率比浊法和终点比浊法；透射免疫浊法和散射免疫比浊法；免疫胶乳比浊法凝集反应与沉淀反应有何异同一、相同点：①都是抗原抗体的特异性反应；②都分为两个阶段，抗原抗体特异性结合和出现可见复合物阶段；③有相同的反应机制和影响因素。二、不同点不同点凝集反应沉淀反应颗粒性抗原抗原性质可溶性抗原或可溶性抗原致敏的颗粒第一阶段：几秒至几十秒第一阶段：数秒至数分钟反应时间第二阶段：几十分钟至数小第二阶段：数分钟至数小时时稀释对象抗体抗原结果出现凝集块出现沉淀物时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）：是以镧系元素标记抗原或抗体，并与时间分辨测定技术相结合而建立起来的一种新型非放射性微量分析技术。它具有灵敏度高、发光稳定、荧光寿命长、自然荧光干扰少、标准曲线范围宽等优点，已在临床检测中广泛使用。【基本原理】1、时间分辨：通常各种组织、蛋白或其他化合物，在激发光照射下都能发出一定波长的自发荧光，这些荧光是非特异性的，会干扰荧光免疫测定，影响其特异性和灵敏度，但它们的荧光寿命常较短（1~10ns），最长不超过20ns。而镧系元素螯合物的荧光寿命较长（10~1000μs），因此，在检测时可在短寿命本底自发荧光完全衰变后，再测定镧系元素螯合物的特异性荧光信号，可有效降低本底荧光的干扰，故称为时间分辨。这是本技术具有高灵敏度的原因之一。2、stokes位移：即激发光谱和发射光谱的波长差。镧系元素stokes位移大（通常为273nm），激发/发射光谱不重叠，用简单的滤光片就能把激发光和发射光分开，可消除激发光散射引起的干扰。3、发射光谱和激发光谱：镧系元素发射光谱带较窄，多在613nm±10