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细胞凋亡(apoptosis)细胞凋亡是一个主动的由基因决定的自动结束生命的过程,凋亡细胞将被吞噬细胞吞噬。生物学意义:①确保正常发育生长:清除多余的细胞②维持内环境稳定:清除受损、突变、衰老的细胞③积极防御功能:对病毒感染细胞阻止复制细胞凋亡过程中有一系列特征性的形态学等的改变。其中最重要和最具有特征性的改变是Ca2+/Mg2+依赖性的核酸内切酶的激活而导致染色质DNA在核小体连接部位断裂,形成以180~200bp为最小单位的单体或寡聚体片段。实验原理材料方法二、提取胸腺细胞DNA:⑴裂解细胞阶段(使用到的试剂:裂解液=L液、RNaseA/蛋白酶K液=A液)将细胞离心后小心倒出液体,离心管中加入100μlL液和20μlA液,充分混匀,置于55℃温浴20分钟,其间来回颠倒离心管3-5次。(2)结合DNA阶段(使用到的试剂:结合缓冲液=B液、3MNaAC,pH4.8)加入10μl3MNaAC,随后加入1250μlB液,充分振荡混合均匀(重要!),12000rpm离心3min。将上清分2次加入到离心吸附管。静置1分钟,12000rpm离心30s,倒掉收集管中废液。第二次同上,静置1分钟,离心30s。(3)漂洗阶段(使用试剂:600ul漂洗缓冲液×2=W液)倒掉收集管中的废液,再加入600ulW液,12000rpm离心30秒。重复上叙步骤,再次加入600ulW液,12000rpm离心30秒。倒掉废液,再次12000rpm离心30秒。三、DNA琼脂糖凝胶电泳:(5)制板:将1%的琼脂糖凝胶加热溶化,取20ml倒板,待凝,取梳。置板于电泳槽中,加电泳缓冲液至淹没过胶。(6)加样:取50uLDNA样品与10uL点样缓冲液,混匀,10ul/孔。(DNAmarker直接加样,5ul/孔)。(7)电泳:点样孔置负极,电压80-100V,电泳至溴酚兰移出2/3距离时,关闭电源。(8)观察:取出凝胶板,置紫外透射仪上,可见绿色DNA区带。结果观察地塞米松诱导小鼠胸腺细胞凋亡1:DNAmarker;2-3:细胞坏死对照4-6:细胞凋亡;7:正常细胞对照基因组DNA抽提试剂盒