设计作品名称槟榔中黄曲霉毒素的检测方案一、设计背景本品为棕榈科植物槟榔ArecacatechuL.的干燥成熟种子。春末至秋初采收成熟果实，用水煮后，干燥，除去果皮，取出种子，干燥。在日常生活中槟榔也很常见，槟榔的功能与主治:杀虫，消积，行气，利水，截疟。用于绦虫病，蛔虫病，姜片虫病，虫积腹痛，积滞泻痢，里急后重，水肿脚气，疟疾。中国药典槟榔项下规定要进行黄曲霉毒素的检测。根据查阅中国知网得知黄曲霉毒素是黄曲霉产生的最主要真菌毒素之一,是公认的一类致癌物。黄曲霉毒素具有高毒性、高致癌性、致突变性和免疫抑制性,严重威胁人畜健康。因此,黄曲霉毒素合成、调控及防控的相关工作一直是食品药品安全领域的研究重点和热点。为保证人民用药的安全、应该对中药中黄曲霉毒素的含量进行控制。鉴于药材质量及工业化生产检测的需要，设计一种科学、方便、有效、可行的槟榔中黄曲霉毒素的检验方案很有必要，为槟榔的质量标准和检验方案提供相关参考依据。图1槟榔原药材与饮片图二、设计依据《中国药典》2020版一部规定黄曲菌毒素是槟榔检验项目的必检项目之一。槟榔每11000g含黄曲霉毒素B1不得过5μg，含黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素B2和黄曲霉毒素B1总量不得过10μg。槟榔黄曲霉毒素的检测原理:本实验测定的基础是抗原抗体间的特异性反应。黄曲霉毒素单克隆抗体被偶联在柱内凝胶上，样品中的黄曲霉毒素经过提取、过滤、稀释，然后将样品提取液通过键合有黄曲霉毒素抗体的亲和柱。此时，黄曲霉毒素键合在亲和柱中的抗体上。之后用蒸馏水将免疫亲合柱上的杂质除去。用甲醇洗脱亲和柱，将黄曲霉毒素从抗体上分离下来。由于黄曲霉毒素有较强的紫外吸收和产生荧光的特性，最后，将过滤的甲醇溶液注入荧光计或HPLC进行测定。目前用于测定黄曲霉真菌毒素的方法主要有液相色谱法和液相色谱-串联质谱法。基于高效液相色谱荧光法设计并完成了一套黄曲霉毒素检测系统。该系统主要由分离系统、恒温控制系统、荧光检测器、主控板和人机交互界面组成。仪器通过分离系统将黄曲霉毒素进行分离,再由荧光检测器激发黄曲霉毒素产生荧光,以光子计数的方式进行信号采集,最终在PC的色谱工作站上显示检测结果。本方案主要参考《中国药典》（一部）（2020年版）、企业内控标准及高效液相色谱仪操作规程，拟采用高效液相色谱法对槟榔中黄曲霉毒素的检测方法进行设计，为槟榔中黄曲霉毒素的质量控制提供参考依据。三、设计方案（一）仪器和材料1.仪器粉碎机（型号为DFY1000，鼎历医疗器械有限公司），千分之一电子天平、十万分之一电子分析天平（岛津JT5003A、AUW120D，岛津科技有限公司）（见下图2），高速分散器（型号为EP-05-28，宁波新芝生物科技股份有限公司），高效液相色谱（岛津LC-10AD见下图3），台式高速离心机（型号TG16-WS，湘仪公司）（见下图4），超声波清洗仪（型号为GD410DP10L，深圳市光点超声波设备有限公司）。2.材料黄曲霉毒素混合对照品（黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素G2。）均由中国药检所提供。甲醇、乙腈（色谱纯，上海艾锐化工有限公司），水为娃哈哈纯净水，免疫亲合柱（2-8℃下储存，不可冷冻（北京中科汇仁科技有限公司）（见下图5）2图2十万分之一电子分析天平图3高效液相色谱仪图4台式高速离心机图5免疫亲和柱（二）溶液的制备1.供试品溶液的制备取槟榔原药材，粉碎，药粉过二号筛，取药材粉末约15g，氯化钠3g精密称定，置于均质器中。精密加入70％甲醇溶液75ml，高速搅拌2分钟（以每分钟转速大于11000转速度），离心5分钟（以每分钟4000转）精密量取上清液15ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，再次离心10分钟（以每分钟4000转的速度），精密取上清液20ml，通过免疫亲合柱（不宜太快，否则吸附不完全，回收率低），流速每分钟3ml,用水20ml洗脱（必要时可以先用淋洗缓冲液10ml洗脱），弃去洗脱液，使空气进入柱子，将水挤3出柱子，再用适量甲醇洗脱，收集洗脱液，置2ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.22μm）滤过，取续滤液，即得。2.对照品溶液的制备精密量取黄曲霉毒素混合对照品（黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素G2。AFB1以0.93μg/ml计算；AFB2以0.30μg/计算；AFG1以0.93μg/ml计算；以0.35μg/ml计算。-20℃避光保存）0.5ml，置10ml的量瓶中，用甲醇稀释到刻