M13噬菌体载体M13是一种含单链（+）DNA（ssDNA）的丝状大肠杆菌噬菌体，其基因组大小为6.4kb。这类载体主要用来获得大量的单链DNA片段，主要用来测定DNA序列（sanger双脱氧法）、基因的定点突变研究、异源双链DNA的分析等。在M13基因组中，除基因间隔区（ISregion）外，其他均为复制和组装所必需的基因。外源DNA插入IS区，可不影响M13活动，因而野生型M13的改造主要在IS区中进行。M13噬菌体的特点感染Ecoli后，在宿主细胞内会形成双链的复制型DNA（replicationformDNA,RFDNA）。可以象质粒DNA那样在体外进行纯化和操作。无论是RFDNA或ssDNA都能转染E.coli的F+或F-细胞。噬菌体颗粒的大小是受其DNA的大小制约的，这一点正好与λ噬菌体相反，所以M13噬菌体并不存在包装限制的问题。M13噬菌体产生单双链DNA的机制1、以（+）链DNA为摸板，合成互补（－）链，该双链称复制型DNA（RFDNA）。2、RFDNA在宿主细胞内能快速增殖，可增加到每个细胞约200个拷贝。3、单链特异的DNA结合蛋白结合在（+）链上，从而阻断了其互补链，即（－）链的合成，这样，细胞就会不断的合成（+）链DNA。4、游离出来的（+）链DNA先与基因V的编码产物形成特异的DNA-蛋白质复合物，然后转移到寄主细胞膜，同时基因V的蛋白质从（+）DNA链上脱落下来，余下的M13（+）链DNA则是从其感染的寄主细胞的细胞膜溢出的过程中，被外壳蛋白包装成病毒颗粒的。M13DNA载体的构建插入一段lacDNA片段，即带有-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列及其N端头146个aa编码信息，宿主F’因子携带缺失第11-41位氨基酸的lacZ’M13DNA载体的特点噬菌体载体和质粒载体比较第一节克隆载体（一）柯斯质粒的构建柯斯质粒：一类人工构建的含有λDNA两端cos序列和质粒复制子的特殊类型的载体。“柯斯克隆”（cosmidcloning）黏粒载体的克隆原理及步骤1．分离外源DNA片段35～45kb2．外源DNA与两个粘粒相连，且cos方向相同3．体外包装：在的A蛋白的功能作用下切割cos位点并将其中的DNA包装到成熟的噬菌体颗粒中去4．感染E.coli：线状的重组DNA被注入细胞并通过cos位点的环化，而形成黏粒载体，象质粒一样复制常用黏粒载体结构图噬菌粒载体由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型的载体系列。它具有质粒的复制起点、选择性标记、多克隆位点等，方便DNA的操作，可在细胞内稳定存在；又具有单链噬菌体的复制起点，在辅助噬菌体的存在下，可进行噬菌体的繁殖，产生单链的子代噬菌体。用于体外转录常用噬菌粒载体的一般特征第一节克隆载体人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百甚至上千kb的DNA片段，此时柯斯质粒(45kb)和噬菌粒载体的装载量也远远不能满足需要。将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。人工染色体克隆载体（artificialchromosomevector）（一）酵母人工染色体（YAC）克隆位点：位于sup4基因内pYAC3酵母人工染色体的使用用pYAC3进行克隆筛选如下：用原生质转化的方法把人工染色体转入酿酒酵母。用作宿主的菌株是双营养缺陷型Trp1-ura3-，可以被人工染色体上的筛选标记基因恢复成Trp1+ura3+。在基本培养基平板上培养，只有含有结构正确的人工染色体的转化体可以生存。如果染色体构建错误，如在被克隆的DNA两侧连接了相同的两段载体DNA片段，则因缺少一种筛选标记，使得转化体不能在基本成分培养基上存活。外源DNA的是否插入，可由SUP4的插入失活判断，即可以很简单地由菌落的颜色看出：红色的菌落是重组体，而白色的菌落则不是。酵母人工染色体（YAC）缺点（二）细菌人工染色体（BAC）(三)P1派生人工染色体结合了P1载体和BAC载体的最佳特性，包括阳性选择标记sacB及噬菌体P1的质粒复制子和裂解性复制子。(四)哺乳动物人工染色体（五）人工染色体克隆载体的应用