ELISA的基本原理免疫标记免疫酶测定法(EnzymeImmunoAssay,EIA)酶联免疫吸附试验(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA)酶联免疫吸附试验(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA)酶联免疫吸附试验(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA)酶联免疫吸附试验(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA)ELISA的试剂标本的采取和保存标本的采取和保存标本的采取和保存标本的采取和保存试剂的准备1.放冰箱内保存的试剂、在使用前应先恢复到室温。2.仔细检查试剂各组分是否变质。3.保存试剂的冰箱应定期检查其贮存温度（正常为2-8℃），并尽量避免冰箱频繁开关。4.试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。5.ELISA中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的。在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。1．严格按照说明书要求，按规定的量和顺序进行。2．使用的微量加样器应注意保养并定期校正。3．加样前应使溶液充分混匀，并将液体加在孔底，避免加在孔壁上部，注意不可出现气泡。加样前要看移液器的液面是否平齐。4．加样时避免样本溅出，如有样本溅出孔外时，应用吸水纸轻轻拭干，并做相应记录。5．加样后微孔板应及时温育，尽量缩短加样后温育前的等待时间。6.如果加样枪漏气以至于加样的量不够，不能用枪吸出再加，避免污染整条甩掉再重新加。温育洗涤显色HRP的底物DH2+H2O2ED+2H2O上式中，DH2为供氢体，H2O2为受氢体。DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物。DH2如：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)和ABTS。TMB经HRP作用后共产物显蓝色。TMB性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与H2O2溶液混和即成应用液。酶反应终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为450nm，是HRP结合物最常用的底物。。HRP对氢受体的专一性很高，仅作用于H2O2、小分醇的过氧化物和尿素过氧化物(ureaperoxide)。显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温育反应。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。TMB（四甲基联苯胺）受光照的影响。但为保证实验结果的稳定性，宜在规定的适当时间阅读结果。TMB经HRP作用后，约40分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至2小时后即可完全消退至无色。不使用过期显色剂，肉眼可见浅兰色的TMB显色剂不能使用。显色剂避免在空气中暴露时间过长。加显色剂尽量避免溅出孔外。37度避光显色。比色酶标比色仪6结果判断4.ELISA的操作要点ELISA的优点：血清学方法有很多种,如传统的琼脂扩散(AGID)、血凝抑制(HA/HI)、乳胶凝集、试管凝集、补体结合等方法，但这些方法不是最合适的检测方法。EILSA技术与其有着不同的特点：1、灵敏度高。ELISA是通过酶促反应放大检测信号,从而提高检测的灵敏度,其检测限可达ng甚至pg水平,可做定量测定。2、特异性强。ELISA的每一步体的特异性识别过程,结构类似物、有色物质、荧光物质等对检测的影响很小。3、样品的预处理过程和ELISA的操作步骤简单快捷，有的试剂盒仅需1~2个小时即可得出检测结果，并且可同时检测数十甚至上百个样品。4、设备简单，适用于基层。谢谢大家！