如果您无法下载资料,请参考说明:
1、部分资料下载需要金币,请确保您的账户上有足够的金币
2、已购买过的文档,再次下载不重复扣费
3、资料包下载后请先用软件解压,在使用对应软件打开
1.称取样品土样5g,加入灭菌的石英砂,液氮研磨;<u>不要液氮研磨,这样子对DNA伤害很大,几乎全部片段化了。可以在这步加上PBS洗涤下土壤,一是能够去除些杂质,二是能够使得土壤处于悬浮状态,然后可以在涡旋仪上剧烈涡旋2-3min,使得土壤颗粒破碎。然后12000rpm离心5min,弃上清。2.加入13.5mL的DNA提取Buffer,100微升20mg/mL蛋白酶K,37℃225rpm摇2h;<u>这步你在37度摇床时间我个人觉得太长了,可以参考文献30min足矣。3.加入700微升20%SDS,65℃水浴2h,间隔15min颠倒摇匀数次;<u>轻柔摇匀,不要太剧烈。4.6000rpm室温离心15min,收集中间液相层;向沉淀中加入3mLDNA提取液,300微升20%SDS,65℃水浴30min,同上离心,收集中间液相层,合并;重复一次;<u>这里可以考虑再增加抽提一次。或者用5mL而不是3mL。最后实在装不下了可以分在两个50mL离心管里面离心。5.向收集的液相层中加入等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提一次,8000rpm离心10min,收集上部液相层;<u>我在做抽提的时候加用了一步酚氯仿,原因是酚能够更好的使蛋白变性。如果不考虑用酚的话,建议你用氯仿异戊醇抽提两次。你会发现颜色会变清不少。6.第5步收集液相层中加入0.1倍体积的乙酸钠,0.6倍体积的异丙醇,4℃过夜沉淀;<u>这个千万不要4度过夜啊,四度过夜你会发现很多的絮状悬浮物,我之前犯过类似错误,这个是SDS和高浓度的盐在低温条件下析出来了。室温放置1-2h就好。7.过夜沉淀物12000rpm离心15min,弃上清;向沉淀中加入10mL冷乙醇洗涤,12000rpm离心5min,弃上清;12000rpm离心30sec,移液枪析出残留液体;8.室温自然干燥沉淀,干燥后向沉淀中加入400微升TE溶解。<u>这步沉淀贴壁很紧,不要用小枪头吹吸搅动,可以将沉淀浸没后放置于4度过夜或数小时,沉淀就会蓬松。提取后,通过Nanodrop和电泳进行检测,再进行进一步的纯化回收。DNA提取液组成:100mMTris,100mMEDTA,200mMNaCl,2%PVPP,3%CTAB,pH9.0对了,里面还有一些小的注意事项,比如所有的枪尖,包括1mL的都要去尖后灭菌。每个步骤动作都要轻柔,这样DNA才会完整。一、脱腐1.10ml离心管中加入0.5g沉积物(干重)和5ml脱腐缓冲液[100mmol/LTris-HCl,PH10.0,50mmol/LNa2EDTA,200mmol/LNaCl,100mmol/LNa4P2O7,1%(质量浓度)PVP,0.05%(质量浓度)TritonX-100],漩涡混合3min,60℃水浴5min,3000×g离心3min。根据上清颜色与洗涤缓冲液颜色无明显差异。(土壤与沉积环境样品腐殖酸脱除新方略,席峰)2.10ml离心管中加入0.5g沉积物(干重)和5mlPBSbuffer(8gNaCl,0.2gKC1,1.44gNa2HPO4,0.24gKH2PO4,溶于1L水中,pH=7.4)旋涡混合3min,60℃水浴5min,3000×g离心3min。根据上清颜色再重复洗涤与离心1-2次,至上清颜色与洗涤缓冲液颜色无明显差异。(从颗粒污泥中提取DNA的几种不同方法比较,陈竹)二、裂解与提取1.冻融+玻璃珠+溶菌酶+SDS法(可用于微生物群落分子生态学研究的活性污泥总DNA提取方法研究,高平平)1)置0.5g沉积物(干重)于10ml的灭菌离心管中离心5min(8000×g,4℃),弃上清,沉淀(约100mg)悬浮于5ml无菌水中。向管内加入0.35g灭菌玻璃珠(直径2~3mm),将离心管管盖拧紧后置于旋涡混合器击打15min,离心8min(8000×g,4℃),弃上清,沉淀用于细胞裂解。2)向沉淀中加入0.5ml灭菌的TENP缓冲液(50mmol/LTris-base,20mmol/LEDTA,100mmol/LNaCl,0.01g/ml聚乙烯吡咯烷酮,pH10),悬浮后将菌液在液氮中冷冻3min,沸水煮2min,重复3次后进行菌体离心(10min,12000×g,4℃)。上清液快速置于冰上留用,沉淀用于进一步裂解。3)将沉淀悬浮在1.5ml的溶菌酶溶液中(0.15mol/LNaCl,0.1mol/LNa2EDTA,15mg/ml溶菌酶,pH8),其中溶菌酶配制成30mg/ml的母液,-20℃保存备用。37℃温浴1h后,向菌液中加入1.5ml10%SDS溶液(0.1mol/LNaCl,0.15mol/LTris-HCl,10%SDS,pH8),上下摇匀,待菌液变清