微生物学实验基础培训laboratoryExercisesinMicrobiology内容纲要实验目的熟悉牛肉膏蛋白胨固体培养基的主要成分液体与固体培养基的配置与灭菌灭菌后固体培养基的分装熟悉器皿与液体灭菌技术熟悉高压灭菌锅的操作实验原理由人工配制适合微生物生长繁殖和积累代谢产物的混合养料称为培养基。含有碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水等物质。按物理状态可分为液体、半固体和固体三类。加热密封锅体内的水，让水蒸气压力升高，提高锅内蒸汽温度而达到对物品灭菌的目的。实验材料1.实验材料高压灭菌锅；玻璃培养皿；玻璃试管，试管架；三角瓶；称重纸；电子天平；水浴锅；铝箔纸；磁力搅拌器；2.实验药品牛肉膏；蛋白胨；NaCl；琼脂（仅在配置固体培养基时添加）；去离子水实验步骤1.培养基成分1升培养基：5g牛肉膏,10g蛋白胨;5gNaCl15g琼脂(仅在配置固体培养基时添加);去离子水2.按培养基配方比例依次准确称取牛肉膏，蛋白胨，NaCl加入烧杯中(固体培养基还需要加入琼脂)。注意：蛋白胨很容易吸潮，在称取时动作要迅速，另外称药品时严防药品混杂。3.在上述烧杯、三角瓶中加入少于所需要的室温去离子水，放置于磁力搅拌器上搅拌，代药品完全溶解后补充水分到所需的总体积。4.如果配置固体培养基，需要将琼脂先添加到已溶解的药品中，再加热溶化。5.通常，配置一升培养基需要添加200微升NaOH。对于有些要求pH值较精确的微生物，培养基的pH可用酸度计控制调节。6.分装1）涂平板的固体培养基可直接用大试剂瓶灭菌。2）根据实验要求，可将配置的完全溶解的培养基分装入试管、三角瓶等容器进行灭菌。注意：固体培养基约为试管高度的1/5灭菌后制成斜面。分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜。半固体培养基以试管高度的1/3为宜。灭菌后垂直待凝。熟悉培养基制备与灭菌技术注意：灭菌时，瓶盖不能拧紧以免灭菌结束形成负压后打不开倒平板的过程靠近酒精灯（10-15cm范围），倒完后迅速将培养皿盖上，待冷却凝固后，将培养皿翻转放置于台上，待用；若暂时不需要使用，则用封口膜缠绕后翻转放置于4℃冰箱，待用。实验目的正确使用接种环熟悉在无菌环境下转移与重新培养熟悉划平板技术熟悉细菌数量计数的方法了解细菌长期保存技术实验原理平板划线法是指把杂菌样品通过在平板表面划线稀释而获得单菌落的方法。菌落形成单位(CFU，Colony-FormingUnits)指单位体积中的活菌个数。在活菌培养计数时，由单个菌体或聚集成团的多个菌体在固体培养基上生长繁殖所形成的集落，称为菌落形成单位，以其表达活菌的数量。平板划线与细菌数量计数（2）灭菌接种环点燃酒精灯，右手以持笔式握持接种环，并放置火焰中烧灼灭菌，先将接种环的接种丝部分置于火焰中，待金属丝烧红并蔓延至金属端，再直接烧灼金属环直至烧红，然后由金属环至金属杆方向快速通过火焰，随后再反方向通过火焰，如此2~3次。然后将接种环移开火焰，待其冷却。平板划线与细菌数量计数（3）取菌种左手持装有菌液的试管，用持有接种环的右手手掌及小指拔取试管塞，将试管管口迅速通过火焰2~3次进行灭菌。将已灭菌且已冷却的接种环伸入菌种管中，取一接种环的菌液，然后退出菌种管，将菌种管管口再次通过火焰2~3次灭菌，塞好试管塞，放至原来的位置。（4）分离划线接种细菌①左手持琼脂平板培养基，尽量使之直立以免空气中的细菌落入其中，并靠近火焰。右手持接种环在琼脂平板上端来回划线，涂成一细菌薄膜（约占平板的1/10），视为一区。划线时使接种环与接种平板面呈30~40度角，以腕力在平板表面行轻而快地来回滑动动作。②旋转琼脂平板90度，烧灼接种环，以杀灭环上的残留细菌，将接种环触及培养基表面以使其冷却。灭菌接种环通过薄膜处作连续平行划线（约占平板1/5），此视为二区。③旋转琼脂平板90度，灼烧接种环灭菌并使之冷却。将灭菌接种环接二区连续平行划线（约占平板1/4），此为三区。④旋转琼脂平板90度，接种环不必再灭菌，接三区连续平行划线，划满平板其余部分，此视为四区。各区接种线间尽量互不交接，以达到细菌逐渐稀释的目的。平板划线与细菌数量计数单菌落再培养——液体培养基在超净工作台上，酒精灯火焰10-15cm范围内，手持灭菌后试管装有液体培养基，试管口与桌面成45oC角。将灼烧过的接种环冷却后，挑取单个菌落，在液体培养基里搅拌数次。将接种后的培养基至于恒温摇床内培养。细菌数量计算在超净工作台上，酒精灯火焰10-15cm范围，取液体菌液1mL并稀释四次，每次稀释10倍（如图）。取每个稀释后的液体菌液1mL或100微升滴于平板上，涂匀后过夜培养。根据可见菌落数量计算原菌液细菌