第一节转基因动物自1981年，美国的Brinster和Palmiter获得世界上第一只转基因动物—“巨鼠”以来，国内外对转基因动植物的研究方兴未艾。到目前，我国也已获得了转基因鼠、转基因鱼、转基因猪、转基因羊、转基因鸡等多种转基因动物。6只体型较原小鼠大一倍左右转基因动物的基本原理是将目的基因（或基因组片段）用显微注射等方法注入实验动物的受精卵或着床前的胚胎细胞中，使目的基因整合到基因组中，然后将此受精卵或着床前的胚胎细胞再植人受体动物的输卵管（或子宫）中，使其发育成携带有外源基因的转基因动物，人们可以通过分析转基因和动物表型的关系，揭示外源基因的功能；也可以通过转入外源基因培育优良的动物品种。转基因技术中所用的外源基因是由顺式作用元件和结构基因组成的完整基因（即完整的转录单位）。由于哺乳类动物之间基因的同源性较高，为了检测方便，有时需引人报告基因(reportergene)或报告序列(reportersequence)。顺式作用元件主要选用有较高表达活性的强启动子（有时包括增强子),或者直接选用目的基因的天然启动子序列。三、转基因动物的基本方法转基因动物的一般实验程序2.胚胎干细胞法（embryonicstemcells，ES细胞）胚胎干细胞是从着床前的动物胚胎中分离获得的一种多功能胚胎干细胞。由于它注射入动物囊胚后可参与宿主的胚胎构成，形成嵌合体，直至达到种系嵌合，因此，可将其作为一种载体，把外源基因导入个体，获得转基因动物。ES细胞可通过磷酸钙-DNA共沉淀法、逆转录病毒感染或电穿孔等方法转染，然后进行筛选和克隆。将外源基因与逆转录病毒载体在体外构建成重组逆转录病毒载体，然后将其转染包装细胞，这时，既可以收获重组病毒颗粒，用于早期胚胎的转染，又可以将胚胎直接加入包装细胞培养物中共培养进行转染。转染后的胚胎可移植给假孕动物完成发育过程。通过DNA与精子共育法、电穿孔导入法和脂质体转染法获得吸附有外源DNA的精子，然后利用其进行受精，将外源DNA导入卵细胞中，经过胚胎的发育，获得整合有外源DNA的转基因个体。5.转基因动物中外源DNA的检测四、转基因动物的应用⑤建立研究外源基因表达、调控的动物模型；⑥对遗传性疾病的研究；⑦建立人类疾病的动物模型，为人类的基因治疗提供依据；⑧动物新品种的培育；⑨基因产品的制备；⑩在免疫学中，可用于对免疫机制、免疫相关疾病的研究及建立免疫性疾病动物模型等。五、已建立的人类遗传病的转基因动物模型第二节基因打靶一、基因打靶的必备条件2.打靶载体打靶载体含有两种筛选标志：neo（新霉素）阳性筛选标志；HSV－tk阴性筛选标志,通过正负选择，可以大大地提高外源基因在染色体特异位点的整合细胞筛选的阳性率。（1）neo阳性筛选标志：将neo基因插入用于打靶的外源DNA中。当外源DNA与细胞染色体上的同源序列发生同源重组时，neo基因也被插入到染色体，因此，发生同源重组的ES细胞能在含G418的培养基中生长。（2）HSV-tk阴性筛选标志：HSV-tk是来源于单纯疱疹病毒的胸腺嘧啶激酶(thymidinekinase)基因，它编码TK，ＴＫ除可以催化脱氧胸苷变成脱氧胸苷酸外，还可以催化一些单核苷类似物磷酸化，这些磷酸化后的核苷类似物对哺乳细胞有很强毒性。将HSV-tk基因插入外源基因外侧的载体序列中，当外源DNA与细胞染色体上的同源序列发生同源重组时，载体部分（含HSV-tk基因）是不能被整合到染色体中的，转化细胞能够在含G418和单核苷酸类似物ganciclovir的培养基上生长。如果细胞能在G418培养基上生长,但不能在含单核苷酸类似物的培养基上生长，说明载体部分亦重组到染色体中。二、基因敲除的基本程序三、基因打靶在医学中的应用2.基因打靶与肿瘤的研究利用基因敲除或敲入小鼠模型，可研究肿瘤相关基因在什么情况下可导致组织细胞恶性生长，从而研究肿瘤的发生、转移及转归的分子机制。3.基因打靶与生物制药国外有家制药公司利用基因打靶技术将小鼠的免疫球蛋白基因从其基因组中除掉，然后将人的免疫球蛋白基因敲入到小鼠的基因组中，这种带有人免疫球蛋白基因的小鼠可以产生人源性抗体。人源性抗体将成为治疗多种疾病的有效药物，其社会和经济价值是无法估量的。四、基因打靶的应用举例基因敲入动物年产奶/kg蛋白含量，%年产纯蛋白量/kg外源基因年表达量Kg动物G0出生G1出生G2出生G3出生10Kg100Kg表三、已建立的人类遗传病的转基因动物模型我国政府和科学界对转基因动物的研究和应用十分重视。在国家“七五”技术攻关计划中首先设立了“动物个体表达系统研究”的课题，启动了转基因动物的研究。在农业部的“七五”生物技术重点项目中，又设立了“动物转基因技术研究”的课题。1987年，当首期"863"计划生物技术领域研究项目开始实施