基因工程与体外表达基因重组示意图限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶Ⅰ型酶具有限制和修饰作用。要求DNA分子上有特定的识别顺序，并在此识别位点下游100至1000bp处切割。Ⅲ型酶与Ⅰ型酶一样，有限制和修饰作用。但在识别位点附近切割DNA，但切点难以预测。Ⅱ型酶并不兼有甲基化酶的活性。在DNA分子内部的识别特异位点并切割双链DNA，切割为点固定、已知，是基因克隆重常用的工具酶。..BamHⅠ来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatibleend)。二、其他常用的工具修饰酶第二节基因克隆的载体（一）质粒(plasmid)——存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子质粒（plasmid）在细胞内的复制分两种类型克隆载体的的质粒应具备下列特点..（二）λ噬菌体(λphage)..（三）粘性质粒(cosmid)（四）M13噬菌体.（五）病毒载体酵母人工染色体(yeastartificialchromosome,YAC)细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome,BAC)动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）除具有克隆载体的性质外，还带有表达构件—转录和翻译所需的DNA序列。（一）大肠杆菌表达载体含复制起始位点、抗性基因、克隆位点，可以导入大肠杆菌。表达载体中含启动子、核糖体结合位点、克隆位点、转录终止信号。1.启动子：trp-lac(tac)启动子：由trp启动子加上lac操纵子中的操纵基因、SD序列融合而成。λ噬菌体PL启动子：一种温度诱导的启动子。T7噬菌体启动子：表达效率很高的启动子。2.核糖体结合位点：SD序列3.转录终止序列(二)真核表达载体②在真核宿主细胞中表达重组基因所需要的元件，包括启动子、增强子、转录终止和加poly-A信号序列、mRNA剪接信号序列、能在宿主细胞中复制或增殖的序列，能用在宿主细胞中筛选的标志基因、以及供外源基因插入的单一限制性内切酶识别位点等。第三节基因克隆的基本过程一、目的基因的获取（二）cDNA文库将某一时间某一种类细胞中所有的cDNA的混合体与载体进行连接，使每一个cDNA分子都与一个载体分子拼接成重组DNA，将所有重组DNA分子引入宿主细胞并进行扩增，得到分子克隆的混合体称为cDNA文库。（三）PCR扩增特定基因TA克隆系统由Invitrogen公司发展而来的商业试剂盒，它用于PCR产物的克隆和测序。其原理是利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（MCS）中。四、人工化学合成二、载体的选择与制备方式：(1)同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接配伍末端连接非配伍末端连接BamHⅠ切割反应不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接平端连接目的基因在末端转移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。四、将重组体DNA分子导入宿主细胞3、转染指真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。转染方法：1、磷酸钙共沉淀法2、电穿孔法3、DEAE-葡聚糖法4、脂质体介导基因转染5、显微注射法五、目的基因的筛选与鉴定(插入失活法)抗药性标记选择组氨酸缺陷型大肠杆菌α互补的检测原位杂交Southern印迹4、PCR技术对特定DNA进行直接鉴定5、利用限制性内切酶酶切图谱鉴定DNA第四节真核细胞的转染二、转染细胞的筛选（二）药物筛选转染细胞第五节基因的改造一、基因定点诱变技术步骤：2.含U模板法3.PCR定点诱变法：高效定点诱变技术原理：除合成所需的5’端和3’端常规引物（a，d）外，再合成一对带有诱变位点的互补寡核苷酸引物（b，c）。分别利用诱变引物b和5’端引物a，及诱变引物c和3’端引物d扩增出两个诱变的片段（a/b片段和c/d片段）。经去除扩增反应的剩余引物后，将扩增出两个诱变的片段等量混合、变性、退火，用DNA聚合酶Ⅰ大片段补齐。再利用5’端和3’端常规引物进行PCR扩增，得到定点诱变的DNA片段。二、基因定点诱变技术的应用长效胰岛素快速吸收的胰岛素增加与受体亲和力的胰岛素第六节克隆基因的表达（二）、提高外源基因表达水平1、提高翻译水平：调整SD序列与ATG之间距离；用点突变的方法改变某些碱基；增加mRNA的稳定性。2、将细菌生长与外源基因的表达在时间上分开：减轻细胞的代谢负荷3