牛乳中酪蛋白得制备与浓度测定一、实验目得1、学习从牛乳中分离酪蛋白得原理与方法２、掌握等电点沉淀法提取蛋白质得方法3、了解紫外吸收法测定蛋白质浓度得原理,熟悉紫外分光光度计得使用4、学会用考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度二、实验原理1、准备酪蛋白原理:牛乳中主要含有酪蛋白与乳清蛋白两种蛋白质,其中酪蛋白占了牛乳蛋白质得80%、牛乳在PH４。7时酪蛋白等电聚沉后剩余得蛋白质统称为乳清蛋白、酪蛋白就是白色、无味得物质,不溶于水、乙醇等有机溶剂,但溶于碱溶液。乳清蛋白不同于酪蛋白,其粒子得水与能力很强,分散性高,在乳中呈高分子状态。本法利用等电点时溶解度最低得原理,将牛乳得PH调至4。７时,酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物,除去脂类杂质后便可得到纯得酪蛋白。2、紫外吸收法测定蛋白质浓度得原理:大多数蛋白质由于有酷氨酸与色氨酸得存在,在紫外光280nm有吸收高峰,可以进行蛋白质含量得测定。但就是核酸在２80nm也有吸收,干扰测定,不过核酸得最大吸收峰在２６0nm,通过测定在28０nm与260ｎｍ时Ａ得比值,然后通过计算消除核酸存在得影响,可以求得有核酸存在时蛋白质得浓度。3、考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度原理:考马斯亮蓝能与蛋白质得疏水微区相结合,这种结合具有高敏感性。考马斯亮蓝Ｇ250得磷酸溶液呈棕红色,最大吸收峰在465nm、当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色,其最大吸收峰改变为5９5nｍ,考马斯亮蓝G２5０—蛋白质复合物得高消光效应导致了蛋白质定量测定得高敏感度。在一定范围内,考马斯亮蓝G250—蛋白质复合物呈色后,在595nm下,吸光度与蛋白质含量呈线性关系,故可以用于蛋白质浓度得测定。三、实验器材与试剂1、制备酪蛋白:烧杯、玻璃棒、量筒、精密PH试纸、离心机、布氏漏斗、表面皿、恒温水浴锅牛奶、醋酸缓冲液、冰醋酸、9５%乙醇、无水乙醚２、紫外光吸收法:紫外可见光分光光度计、容量瓶50ml(×1)、石英比色皿0.9％NaＣl、1ｍoｌ／LNaOH溶液、1ｍol/Ｌ乙酸溶液3、考马斯亮蓝法:紫外可见光分光光度计、试管1．5cm×１5cm(×9)、玻璃比色皿牛血清白蛋白(0.1ｍg／ｍl)、考马斯亮蓝、0。9%ＮaCl四、实验步骤制备酪蛋白1、将20mLpH４。７得醋酸-醋酸钠缓冲液预热至40℃２、将2０ｍＬ牛奶加热至４0℃,在搅拌下缓慢地加入20ｍL预热得ｐH4。7得醋酸—醋酸钠缓冲液3、用精密pH试纸调pＨ至4.7,可见溶液变为乳白色悬浮液４、待悬浮液冷却至室温,400０ｒｐm离心5min,弃上清,得酪蛋白粗制品5、用蒸馏水洗沉淀3次,3000rｐm离心5min,弃上清6、在沉淀中加入20mＬ９5％乙醇,搅拌片刻,将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤7、用乙醇—乙醚混合液洗涤沉淀2次(1０ml／次),最后用乙醚洗涤沉淀2次(1０mｌ/次),抽干8、将沉淀摊开在表面皿上,风干,得酪蛋白纯品９、准确称量,计算含量与得率紫外光吸收法１.取待测样品溶液置于得石英比色皿中,于分光光度计波长２80ｎm与260nm,分别读取A２8０nm与A2６0nm,用生理盐水为比色空白对照。2.若A280nm/A２60nm>１、5,用公式:蛋白质含量(ｍg/ｍl)=A２8０nｍ／6、3＊1０若A２80ｎm/Ａ2６０nｍ<1。5,用公式:蛋白质含量(ｍg／ml)＝１．4５Ａ280nm—0。7４Ａ260nm考马斯亮蓝法取９支干净试管,按表进行编号并加入试剂、混匀,室温静置３miｎ,以第1管为空白,于波长５95nm处比色,读取吸光度,以吸光度为纵坐标,各标准液浓度(μg/mｌ)作为横坐标作图得标准曲线。五、实验数据酪蛋白质量:0.５421g酪蛋白含量:２.7１g/１００ｍl牛乳紫外光吸收法:Ａ280ｎm0．76９AA260nｍ0.９5９ＡＡ280nm/Ａ２60ｎm<1。5,蛋白质含量(mg/ml)=１。４５A280ｎm—０.７4Ａ260nm=0、405mｇ/ml考马斯亮蓝法管号1(空白)23４5６7８９标准蛋白液／ml00、1０。２0.30。４0、60.8—-样品／ml———-——-110.9%NａＣｌ/ｍｌ10、90。８0、7０、60。40、20０考马斯亮蓝染液／ml4。04.04、０4。04、0４。04.０４。04、0蛋白质浓度/(μg/ml)80A５９5ｎm０0.1４00、2８80、430、５7６0、6550。９720。17８0。26２蛋白质浓度为ﻬ