胃癌胰岛素样生长因子基因的印迹状态的检测一、基因印记的概念是一种在基因组DNA水平对双亲等位基因特异性的修饰作用。结果导致来自不同性别亲本（父母）的同源染色体上等位基因存在功能上的差异。驴马正反杂交实验结果公驴—母马公马—母驴骡駃騠基因组印迹现象最早由HelenCrouse于1960年在昆虫研究中首次提出。Sciara昆虫的两条X染色体1980年，Cattanach等人发现，具有两条母源11号染色体的小鼠在胚胎期比正常小鼠小，而具有两条父源11号染色体的小鼠在胚胎期比正常小鼠大。但是，这两种小鼠胚胎都无法正常发育而死于发育阶段。1984年，McCrath等人用人工单性生殖的方法产生了两种特殊类型的小鼠胚胎：一种小鼠胚胎的全套染色体全部来自雄性亲本，另一种小鼠胚胎的全套染色体全部来自雌性亲本。但两类小鼠均在发育期死亡。1991年，Dechiara等人做了小鼠IGF-2剔除基因的实验，首次证明了生物体本身带有基因组印迹基因。实验发现，敲除父源IGF-2等位基因小鼠发育成成体个体小，但若剔除的等位基因来自母源，动物的个体没有变化。直至1993年，Feinberg实验室首次发现了基因组印迹也存在于人类。二、基因组印迹与肿瘤的关系IGF-2作为印迹基因，在正常人群里，只有父系的等位基因表达，母系的等位基因则处于静止状态。约有40%WT的患者肿瘤组织中发现有IGF-2等位基因父母系共同表达。这种静止的基因被重新活化表达的现象，称作LOI（Lossofimprinting）。结肠癌患者也可检测到IGF-2的LOI现象，而且这种现象不仅存在于癌组织，也存在于癌旁组织和病人的血细胞中。由此被认为这种现象很可能成为该病早期诊断的指标。此外，已经发现与基因组印迹异常有关的肿瘤还有肝癌、卵巢癌、胃癌、肺癌、神经胶质瘤、前列腺癌等等。目前已经被证实与人类肿瘤发生相关的印迹基因除IGF-2外，还有WT1、P57KIP2、P73、NOEY2以及M6P/IGF-2R等等。http://www.geneimprinting.com三、IGF-2基因LOI的检测方法即该序列在人群中存在SNP：等位基因a5’-GGGCCC-3’等位基因b5’-GTGCCC-3’人群中将形成三种基因型：GGTTGT杂合子的鉴定可以通过PCR产物酶切后电泳的方法完成LOI的鉴定可以通过杂合子RT-PCR产物酶切后电泳的方法完成一、实验安排实验一基因组DNA的提取【器材】1．电子天平；2．匀浆器；3．EP管；4．冰盒；5．手套；6．高速离心机【试剂】1．酚；2．氯仿；3．无水乙醇；4．75%乙醇；5．纯水【操作步骤】实验二组织总RNA的提取RNA提取关键:防止内源性和广泛存在的外源性RNA酶，如器皿、试剂和手上等存在的RNA酶对核酸的降解作用，所用材料、器皿均需经DEPC处理（包括0.1%溶液浸泡过夜，蒸馏水冲洗及高压灭菌15min去除残存的DEPC）。【器材】1．电子天平；2．匀浆器；3．EP管；4．冰盒；5．手套；6．低温冷冻高速离心机【试剂】1．TRIzol试剂（Invitrogen/GIBCOBRL）；2．氯仿；3．异丙醇；4．75%乙醇；5．0.1%DEPC处理水实验三反转录聚合酶链反应(RT-PCR)RT-PCR的原理【器材】1．PCR扩增仪；2．恒温水浴箱；3．紫外灯检测仪；4．EP管；5．手套【试剂】1．特异基因引物上游引物：5ˊCTTGGACTTTGAGTCAAATTGG3ˊ下游引物：5ˊCCTCCTTTGGTCTTACTGGG3ˊ2．RT-PCR试剂盒(Takara公司)【操作步骤】2.按以下条件进行反转录反应二、PCR反应2.按以下条件进行PCR反应实验四限制性酶切及电泳检测【器材】1．恒温水浴箱；2．EP管；3．手套【试剂】1．ApaI限制性内切酶；2．10×Lbuffer；3.纯水【操作步骤】一、琼脂糖凝胶电泳线状DNA片段分离的有效范围与琼脂糖凝胶浓度关系【器材】1．水平电泳槽；2．电泳仪；3．紫外透射仪或凝胶成像系统【试剂】1．1%琼脂糖；2．电泳缓冲液(1×TBE)；3．10mg/ml溴化乙锭(EB)；4．电泳样品上样缓冲液(6×)：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯腈，40%（W/V）蔗糖水溶液，在40C保存。1．琼脂糖0.2g，加电泳缓冲液(1×TBE)20ml，加热熔化。2．胶液冷至50C时，加EB2l，小心混匀，缓慢倒入制胶模具中，在胶一端插上梳子。3．待胶凝固后，拨出梳子，将胶凝置于电泳槽中，加入1×TBE，让液面高于胶面2–3mm。4．在DNA样品中加入2×上样缓冲液并混匀，将DNA样品胶凝的样品孔中。5．电泳槽与电源接通后，DNA样品开