糖基化介导RCA与qPCR联用检测5-羟甲基胞嘧啶的任务书任务书题目：糖基化介导RCA与qPCR联用检测5-羟甲基胞嘧啶一、研究背景5-甲基胞嘧啶（5-mC）和5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）是DNA甲基化中最为重要的标记。近年的研究表明，5-hmC不同于5-mC，在DNA复制、转录和修复等过程中发挥着不同的生物学功能。5-hmC是5-mC的氧化产物，在几乎所有的组织都有存在。而且，5-hmC水平在某些生物学过程中会发生动态变化，例如在胚胎发育和成人神经系统发育中，5-hmC水平会在不同的时期高低波动。因此，5-hmC成为标记生物学过程的新的重要指标。目前，最常用的5-hmC检测方法是液相质谱法和免疫化学检测法。这些方法在检测灵敏度和准确性方面已经有了很大的提高。然而，这些方法仍然受到诸如高成本、高技术难度和需要复杂样品处理等问题的影响。因此，探索一种新的5-hmC检测方法成为研究的热点。二、研究意义在分子生物学领域，5-hmC被广泛地用作基因组解读和表观遗传调节研究的工具。将糖基化介导循环扩增（RCA）和荧光定量PCR（qPCR）联用检测5-hmC，可大幅降低检测成本及技术难度，提高检测灵敏度和准确性，并且具有较高的特异性和选择性。因此，本研究具有重要的应用和理论意义。三、研究内容（1）选择5-hmC和非5-hmC位点；（2）以人血液DNA中5-hmC和非5-hmC位点为靶标，开展糖基化介导RCA与qPCR联用检测5-hmC的方法建立和优化；（3）优化糖基化介导RCA反应，可行性探讨反应缩短时间和提高灵敏度等；（4）建立5-hmC和非5-hmC标准曲线；（5）对比qPCR和免疫化学法在血液DNA中的5-hmC检测结果。四、预期成果（1）从人体DNA中筛选5-hmC和非5-hmC位点；（2）建立糖基化介导RCA和qPCR联用检测5-hmC的方法；（3）优化糖基化介导RCA反应，缩短反应时间并提高灵敏度等；（4）建立5-hmC和非5-hmC标准曲线；（5）对比qPCR和免疫化学法在血液DNA中的5-hmC检测结果。五、研究方法和技术路线（1）筛选5-hmC和非5-hmC位点，将人血液DNA提取并对其进行限制酶切；（2）设计引物序列，开展糖基化介导RCA反应；（3）利用荧光探针和光合基团进行荧光定量PCR检测；（4）建立5-hmC和非5-hmC标准曲线；（5）对比qPCR和免疫化学法在血液DNA中的5-hmC检测结果。六、参考文献1.Kriaucionis,S.&Heintz,N.ThenuclearDNAbase5-hydroxymethylcytosineispresentinPurkinjeneuronsandthebrain.Science324,929–930(2009).2.Song,C.X.etal.Genome-wideprofilingof5-formylcytosinerevealsitsrolesinepigeneticpriming.Cell121,427–14(2015).3.Jang,H.-S.etal.5-Hydroxymethylcytosineepigeneticchangesduringconversionofhumansomaticcellsintoinducedpluripotentstemcells.Sci.Rep.8,1–10(2018).4.Liu,J.etal.DNAhydroxymethylationby5–mCto5–hmCconversioncontributestoepigeneticinheritance.Sci.Adv.6,eaay7241(2020).