第十七章高效液相色谱法课程引入：★食品中苏丹红事件？★水果、蔬菜中的有机磷农药残留？★“三鹿奶粉事件”中三聚氰胺的分析？17-1概述高效液相色谱法的特点：高压、高效、高速、高灵敏度。适用于高沸点、热不稳定及生化试样的分析。17-2高效液相色谱仪液相色谱仪（2）液相色谱仪（3）液相色谱仪（4）一、流程及主要部件1.流程9GC和HPLC在分离上的主要区别：GC：流动相为惰性气体，分离主要取决于组分分子与固定相间的作用力，主要通过改变固定相来改变对组分的选择性。GLC中，流动相对组分作用极弱，一定柱温下，固定液流失主要由高柱温造成其自身挥发，所以，在应用中主要采用涂渍的方法制备柱子。GSC中，无固定液流失现象。HPLC：流动相与组分分子间有一定的亲和力；分离是由组分、流动相和固定相三者相互作用的结果。流动相是极性不同的有机溶剂或缓冲水溶液，溶解能力强。在HPLC中，固定液分子必须键合在填料上，否则，流失严重。另外，填料的颗粒直径一般为3～5μm，柱子制备复杂。因此，在应用中，主要以改变流动相来调节分离的选择性。高效液相色谱仪一般可分为4个主要部分：高压输液系统进样系统分离系统检测系统还配有辅助装置：梯度淋洗自动进样数据处理等2.主要部件(1)高压输液泵①压力：150～350×105Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm，常用3~5μm），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。②应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性。高压输液泵的种类：①恒压泵—液压隔膜泵和气动放大泵。②恒流泵—螺旋注射泵和往返柱塞泵。（2）梯度淋洗装置HPLC有等梯度洗脱和梯度洗脱两种。前者保持流动相组成、配比恒定。后者采用两种或多种不同极性的溶剂，在分离过程中按照程序连续改变流动相的浓度配比及极性。梯度淋洗的作用：提高分离度缩短分析时间提高分析精度梯度淋洗的方式：①内梯度—高压梯度装置（目前广泛采用）利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。（先加压后混合）②外梯度—低压梯度装置通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例混合后，再用一台高压泵输入色谱柱中。（先混合后加压）(3)进样装置分为手动进样（进样器进样和阀进样）和自动进样（自动进样器进样）两种。流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置。(4)高效分离柱柱体为直型不锈钢管，内径1～6mm，柱长5～40cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。(5)高效液相色谱检测器①紫外光度检测器（UV）最常用的检测器，可用于梯度洗脱。如固定波长型的汞灯254nm或280nm的紫外检测器、可调波长的氘灯或氢灯(200-400nm)。不锈钢池＜10μL。对UV无吸收的组分不响应；对UV吸收较大，如苯不可作流动相。②光电二极管阵列检测器（DAD）为新型的紫外吸收检测器。以氘灯为光源，绘制出随时间变化的光谱吸收曲线（A～λ）计算机快速处理，可获得分离组分的三维彩色谱图，得到更多信息。22③示差折光率检测器（RID）—通用型。每种物质具有不同的折光指数，可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值，差值与浓度呈正比。灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱。④荧光检测器（FD）—选择性检测器高灵敏度、高选择性；对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸等化合物有响应。17-3高效液相色谱法的类型影响分离的主要因素有流动相的流量、性质和极性。1.流速①流速大于0.5cm/s时,H～u曲线是一段斜率不大的直线。②降低流速，柱效提高不是很大。③但在实际操作中，流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重要可选择参数。2.固定相及分离柱①气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。②选择合适的固定相，降低填料粒度可显著提高柱效，但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。③选择短柱、细内径提高分析速度。研制高效柱填料是一活跃领域。3.流动相及流动相的极性①可显著改变组分分离状况的流动相选择在液相色谱中显得特别重要。液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。②亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。——适合极性化合物分离。③若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。——适合非极性化合物分离。4.流动相组成①流动相按组成不同：分为单组分和多组分。②按极性不同：分为极性、弱