实用高效液相色谱法的建立纠错版_第8章_梯度洗脱（常用版）(可以直接使用，可编辑完整版资料，欢迎下载）第8章梯度洗脱8-1引言如前所述，等度分离在洗脱全过程中流动相组成不变（例如50%甲醇-水），而在梯度洗脱中流动相组成随运行过程是变化的（例如5→100%甲醇-水）。梯度洗脱中一般采用二元（溶剂）流动相：A与B，其中强溶剂B的浓度（%B）在运行过程中逐渐增加。图8-1所示为几种不同类型的梯度变化，其中线性梯度最为常用。除另有说明，本书中均假设为线性梯度。图8-1所示为流动相组成在20min内，B浓度由0增大为100%（线性梯度，5%/min）。许多样品用梯度洗脱会分离更好，但许多实验室却对梯度洗脱的应用存在很大偏见。其原因有如下几点：1、有些实验室尚不具备梯度洗脱设备。2、梯度洗脱更复杂，似乎更难进行新方法建立与常规分析。3、某些HPLC检测器（如示差折光检测器）不能使用梯度洗脱。4、每次运行梯度洗脱后需重新平衡色谱柱，耗时较长。5、不同设备的分离结果可能不同，所以梯度洗脱法移植时会出现差异。6、梯度洗脱中的基线问题更为普遍，并且必须使用高纯溶剂。7、某些色谱柱╱流动相的联合应用不适于梯度洗脱。如权衡采用梯度洗脱对每一分离的优缺点，那么很多分离将只适于使用梯度洗脱。本章中我们将说明梯度洗脱分离实际上与等度洗脱非常相似，因此梯度洗脱的方法建立和日常操作与等度洗脱相比并不太难。在8-5节中我们将探讨上述列举的梯度洗脱中存在的问题，以及如何避免或减少这些问题的方法。图8-1不同的梯度形状下面的讨论主要针对反相条件，但是其它HPLC模式的梯度洗脱也遵循相同的原理。我们以目前对梯度洗脱详尽而全面的理解，可以通过几次初始实验的分离情况对以后分离进行准确地预测（见10-2-2节）。8-2梯度洗脱的应用1、具有较宽k值范围的样品（即等度条件下不可能使所有谱峰达到0.5<k<20）。2、大分子样品（如分子量大于1000，尤其是生物样品，见第11章）。3、样品含有晚流出干扰物，它们会污染色谱柱或在后续运行中流出。4、溶于弱溶剂的样品稀溶液（如用反相柱分离的样品水溶液）。此外，即使最终有可能使用等度方法，初始实验采用梯度洗脱往往是HPLC方法建立的最佳起点。8-2-1梯度洗脱用于常规分析8-2-1-1样品的保留值范围选择梯度洗脱的一般理由是样品具有较大的保留值范围。图8-2所示为二烷基邻苯二甲酸酯混合物的分离，该同系混合物包括二甲基（1）、甲乙基（2）、二乙基（3）、二正戊基（9）邻苯二甲酸酯，在C8柱上采用不同组成的乙腈-水流动相进行分离。50%B的等度分离可以获得较好分离度[见图8-2a关键峰对1╱2的Rs=1.5，但运行时间较长（70min）]；而且，后面谱峰（8和9）展宽，难以检测。采用较强流动相（65或80%B；图8-2b和c）可使运行时间缩短，峰8和9变窄，有利于检测和定量。然而，前面谱峰1~4的分离效果变得很差（关键峰对的Rs<0.8）。由于前面谱峰需用较弱流动相（如50%B），而后面谱峰需用较强流动相（如80%B），所以该样品采用等度条件分离不够理想。图8-2二烷基邻苯二甲酸酯同系物的反相HPLC分离样品峰为C2（二甲基，1号峰）至C10（二正戊基，9号峰）；25×0.46cm5μmC8柱，乙腈（B）-水流动相；2.0ml/min；600C。该样品采用梯度洗脱则分离很好（见图8-2d）：10min梯度，20→100%B。所有峰均很好地分离（关键峰对1╱2的Rs=1.5），运行时间仅11min，所有谱峰都很窄，利于检测及准确定量。对于保留值范围较宽的样品，梯度洗脱显然是良好的选择。采用梯度洗脱的另一个原因是：在等度洗脱条件下，k>20的晚流出峰往往会出现较严重拖尾，如图8-3a中羧酸混合物的离子交换分离。而采用梯度洗脱的同一样品（图8-3b），色谱图中最末峰仍较窄，峰形也很好，前面谱峰的分离得以改善。然而应注意，梯度洗脱并不能解决所有谱峰的拖尾问题。图8-3离子交换色谱分离芳香羧酸混合物（a）55mM硝酸钠水溶液流动相的等度分离；（b）10→100mM硝酸钠水溶液流动相的梯度洗脱。8-2-1-2大分子样品组分大分子量样品（肽、蛋白质、合成聚合物等）一般采用梯度洗脱分离会更好，尤其用反相分离条件时。这类样品的等度保留往往对于流动相组成（%B）的微小改变极其敏感，难以将保留值控制在合适的范围内。例如丙醇-水流动相等度RPC分离碳酸酐酶（一种分子量29000Da的蛋白质）时，仅改变±0.1%B，则会导致保留时间±20%的变化。当用梯度洗脱代替等度条件时，HPLC分离大分子时也会使峰形有较大改善。8-2-1-3晚流出组分有些样品采用等度洗脱可很好地分离（有关谱峰达到0.5