重组基因医学知识讲座基因重组(geneticrecombination)是指在体外用酶学方法将不同来源的DNA进行切割、连接，组成一个新的DNA分子的过程，又称DNA重组。基因克隆(genecloning)将重组DNA分子导入到合适的受体细胞中，使其扩增和繁殖，以获得大量的同一DNA分子，称此为基因克隆、DNA克隆或分子克隆。基因工程(geneticengineering)是将不同来源的DNA片段与载体分子连接形成重组DNA分子，再导入宿主细胞内进行表达，也称重组DNA技术。本章主要内容重要的工具酶基因克隆常用的载体重组DNA基本原理重组技术在医学和制药工业中的应用第一节重要的工具酶一、限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)是一类由细菌产生的能专一识别双链DNA结构中的特异碱基序列，并在特定的位点进行切割的内切酶，简称限制酶。根据限制酶作用特性，一般分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，其中常用的是Ⅱ型限制酶。命名：HindIII属种株同一株具不同特异性酶限制酶（Ⅱ型）识别及切割位点特异识别及切割47个bp长度且具有回文序列的DNA片断，主要产生3种末端结构：5ˊ－粘性末端3ˊ－粘性末端平端或钝端回文序列(palindrome)是指该部位的核苷酸序列呈180O反向重复;粘性末端(stickyend)是指经内切酶特异切割后产生的5ˊ－末端突出和3ˊ－末端突出的碱基序列相互间具有互补性。⑴产生5'-粘性末端⑶产生平(头末)端/钝端常用限制性核酸内切酶的特性限制性内切酶的应用通过切割不同来源DNA双链的特异碱基序列，产生含有黏性末端或平端的、长度不同的DNA片段。用于DNA重组、制备探针、分子杂交、DNA序列分析等。重要的工具酶第二节基因克隆常用的载体一、载体必须具备的基本条件二、载体的分类*三、常用的载体总而言之，质粒载体应该是一种分子量较小、高拷贝的“松弛型”质粒，且具有一个以上遗传标志和多克隆位点的质粒。广泛应用的质粒：pBR32质粒、pUC系列等pBR322质粒pUC系列质粒λ噬菌体感染细菌后的两种生长途径溶菌性生长噬菌体感染细菌后，借助其2个COS位点互补成环，在宿主菌体内连续复制，合成大量基因产物，进而装配成噬菌体颗粒，裂解宿主菌，释放出来的噬菌体又可感染其他细菌。溶源性生长噬菌体感染细菌后，可将自身DNA整合到细菌的染色体中去，与之一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不被裂解。第三节重组DNA基本原理一、目的基因的获取（分）（一）制备基因组DNA（基因文库，genomiclibrary）分离、纯化基因组DNA在EDTA等存在下，用蛋白↓RE酶K消化细胞、酚抽提；大小不同酶切片段常用蔗糖梯度离心或电泳↓分离酶切片断；分别与同样RE酶切的载体连接常用噬菌体载体或质粒载体↓DNA连接酶连接；导入宿主细胞、扩增导入宿主细胞内培养、扩增；↓得到分子克隆混合体用分子杂交等方法进行鉴定、（基因文库）筛选、再扩增，分离、回收。（二）制备cDNA（cDNA文库）（三）聚合酶链反应(PCR)二、目的基因与载体的连接（接）（主要有以下4种连接方式）1)粘性末端连接2）平头末端连接3）人工接头法4）同源多聚尾连接法（一）粘性末端连接将目的基因和载体用同一种限制酶酶切，产生相同粘性末端，再通过DNA连接酶作用将两者连接起来，构成重组DNA分子。（二）平头末端连接有些限制酶只能将目的基因和载体DNA切割成平端，此时在T4DNA连接酶的作用下同样能连接起来。（三）人工接头法合成连接子→与DNA平头末端连接→限制酶切割,产生粘性末端→连接，构建重组DNA。（四）同源多聚尾连接法三、重组DNA导入宿主细胞（转）重组DNA导入宿主细胞的类型转化以质粒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程；转染以病毒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程；转导以噬菌体作载体构建的重组体导入受体细胞的过程。感受态细胞用特殊方法处理（CaCL2）后，受体细胞才具备接受外源DNA的能力，这种细胞称感受态细胞。感受态细胞有原核细胞和真核细胞两大类。四、重组DNA的筛选与鉴定（筛）（筛选含重组体的阳性菌落，一般有下列几种方法）1）平板筛选2）限制酶切图谱筛选3）PCR筛选重组体4）原位杂交技术（一）平板筛选是指利用载体的遗传性标记在平板上直接筛选的方法。具有抗药性标记的载体，转化宿主细胞后，能在含抗生素（Amp或Tet）的培养平板上生长；未转化的则不能生长。插入失活当外源DNA序列插入质粒中某一抗药基因内，使该基因失活，转化细胞就不能生长在含相应抗生素的培养平板上。抗生素平板筛选（插入失活）2.蓝-白筛选