目的1强化学生对电泳基本原理的理解与记忆。2熟记聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的基本原理、学会操作。原理区带电泳的分类2．按支持物的装置形式不同，可分为：(1)平板式电泳，支持物水平放置，是最常用的电泳方式。(2)垂直板式电泳。(3)连续流动电泳，首先应用于纸电泳，将滤纸垂直竖立，两边各放一电级，缓冲液和样品自顶端下流，与电泳方向垂直。可分离较大量的蛋白质。以后有用淀粉、纤维素粉、玻璃粉等代替滤纸，分离效果更好。3．按pH的连续性不同，可分为：(1)连续pH电泳：电泳的全部过程中缓冲液pH保持不变。如纸电泳、乙酸纤维膜电泳。(2)非(不)连续pH电泳：缓冲液与支持物之间有不同的pH，如聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳、等电聚焦电泳、等速电泳等，能使分离物质的区带更加清晰，并可作ng级微量物质的分离。聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)是一种人工合成的凝胶，它是由丙烯酰胺(Acr)和交联剂亚甲基双丙烯酰胺(Bis)在催化剂作用下，聚合交联而成的含有酰胺基侧链的脂肪族大分子化合物。聚合反应常用的催化剂有过硫酸胺及核黄素。为了加速聚合，在合成凝胶时还加入四甲基乙二胺作为加速剂。聚丙烯酰胺凝胶具有网状立体结构，且可通过控制Acr的浓度或Acr与Bis的比例合成不同孔径的凝胶，以适用于分子大小不同物质的分离。聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)丙稀酰胺（单体）＋N,N-甲叉双丙稀酰胺（交联剂）→（催化剂）→聚合催化剂：过硫酸铵＋四甲基乙二胺（TEMED）改变单体和交联剂浓度可改变凝胶孔径SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）是目前最常用的分离蛋白质的电泳技术。下面就SDS-PAGE的基本原理做简单介绍。SDS－PAGE电泳的基本原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS，SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物。这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，因此在进行电泳时，向阳极移动。图1标准蛋白质与待测样品电泳图谱分类本实验采用SDS-PAGE对血清蛋白进行分离，考马斯亮蓝R-250染色，经脱色后，观察其组成和相对含量(血清蛋白通过SDS-PAGE一般可分出12-16条区带)。实验试剂和器材1.高分子量标准蛋白试剂盒:兔磷酸化酶BMW=97,400牛血清白蛋白MW=66,200兔肌动蛋白MW=43,000牛碳酸酐酶MW=31,000胰蛋白酶抑制剂MW=20,100鸡蛋清溶菌酶MW=14,400置-20℃保存，使用前室温融化，沸水浴中加热3-5分钟后上样。2.样品：兔血清3.30%丙烯酰胺（Acr）：称Acr29g，甲叉双丙烯酰胺（Bis）1g，加蒸馏水至100ml，过滤后置棕色瓶中4℃储存4.10%SDS（十二烷基磺酸钠）5.10%过硫酸铵(AP)6.TEMED（四甲基乙二胺）7.2x上样缓冲液：10%SDS（4ml）+巯基乙醇（1ml）+0.2%溴酚蓝（2ml）+甘油2ml+1MpH6.8Tris-HCl（1ml）8.浓缩胶缓冲液（1MTris-Cl缓冲液pH6.8）9.分离胶缓冲液（1.5MTris-Cl缓冲液pH8.8）10.固定液：取乙醇500ml，冰乙酸100ml混匀，定溶至1000ml。11.染色液：称取考马斯亮蓝R2501.25g，甲醇225ml，冰乙酸50ml，双蒸水225ml.12.脱色液：冰乙酸80ml，乙醇250ml，加蒸馏水定容至1000ml。13.电泳缓冲液（SDS20g，Tris60g,甘氨酸282.2g,pH8.3）加蒸馏水使其溶解后定容至2000ml。实验器材实验步骤3）先用刀片将琼脂糖剥离开，再将玻璃板从架子上取出，再用夹子固定在电泳槽内（注意凹槽朝内），将电泳缓冲液倒入电泳槽内。3.样品预处理取0.5ml样品加入0.5ml上样缓冲液，置沸水中煮5分钟。4.上样1）第一个孔内加20ul标准蛋白质溶液2）其他每孔加入20ul样品。上样时要将移液枪头垂直插入孔内且要缓慢匀速推入样品5.电泳接通电源，将电压调至80V、50mA。当溴酚兰进入分离胶后，把电压提高到150V、80mA，电泳至溴酚兰距离胶底部1-2cm处，停止电泳6.固定取下凝胶，置于培养皿中的固定液中，轻轻振摇10分钟，倒去固定液7.染色脱色培养皿中倒入50-60度预热的染色液浸没凝胶，约40分钟后回收染色液，用清水冲洗掉胶上多余的染色液。倒入脱色液，防止2小时，期间换脱色液2-3次注意事项图1标准蛋白质与待测样品