PCR基因的原理PCR原理PCR的基本原理PCR基因扩增仪的工作原理技术在PCR反应体系中加入特异性的荧光染料或探针，荧光信号的变化真实地反映了体系中模板的增加，通过检测荧光信号，从而实时监测整个PCR反应过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。荧光定量PCR检测的是样本的初始浓度，而准确测定初始浓度需要在对数期进行。Ct值，C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。Ct值分析实际上就是低浓度的荧光值分析。由于是低浓度，影响因素小，所以具有良好的重现性。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。ThebiggestdisadvantageofSYBRisthatitbindstoanydsDNA;thespecificproduct,non-specificproductsandprimerdimersaredetectedequallywell.TheLightCyclerInstrumentallowsmeltingcurveanalysisOncethemeltingpointoftheproducthasbeendeterminedtheLightCyclerInstrument'sflexibleprogrammingallowstheusertoacquirefluorescenceabovethemeltingtemperatureoftheprimerdimers,butbelowthemeltingtemperatureoftheproduct.2、TaqMan水解探针技术杂交探针技术对PCR产物定量又称荧光共振能量转移，FRET需要一对引物和一对探针，探针A的3`端为荧光染料供体；探针B的5`端作为荧光染料受体。2个探针首尾相连，仅差一个碱基。检测在退火时进行。AdvantagesoftheLightCyclerSystemWatchamplificationasitoccurs:real-time,on-linefluorescenceallowsyoutoseetheresultsofeverycycleassoonasPCRproceedsSavetime:extremelyrapidPCR,20minutesfor30cyclesVerifyampliconspecificity:meltingcurveanalysisprovidesdifferentiationbetweenamplificationproductsDetectmutations:changesinthemeltingcurveanalysiscanbeusedtoidentifymutationsMinimizecontamination:amplificationanddetectionareperformedinthesameclosedtubeHBV的定量检测标准品扩增曲线标准曲线