实验八肉制品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定一、亚硝酸盐测定（一）原理:样品经沉淀蛋白质，除去脂肪后，在弱酸条件下与对氨基苯磺酸重氮化以后，再与N-1-萘基乙二胺偶合形成紫红色染料，与标准比较定量。（二）试剂1.氯化铵缓冲液：在1L玻璃烧杯中，加入500ml水，准确加入20ml盐酸，混匀，准确加入50ml氨水，必要时用稀盐酸和稀氨水调试至pH9.6-9.7。2.硫酸锌溶液（0.42mol/L）：称取120g硫酸锌用水溶解，并稀释至1000ml。3.氢氧化钠溶液（20g/L）:称取20g氢氧化钠用水溶解，稀释至1000ml。4.对氨基苯磺酸溶液：称取1g对氨基苯磺酸，溶于70ml水和30ml醋酸中，置棕色瓶中混匀，室温保存。5.N-1-萘基乙二胺溶液：称取0.1gN-1-萘基乙二胺，加60%醋酸溶解，并稀释至100ml，混匀后，置棕色瓶中，在冰箱中保存，一周内稳定。6.显色剂：临用前将N-1-萘基乙二胺和对氨基苯磺酸溶液等体积混合。7.亚硝酸钠标准溶液：准确称取0.2500g于硅胶干燥器中干燥24h的亚硝酸钠，加水溶解移入500ml容量瓶中，加100ml氯化铵缓冲液，加水稀释至刻度，混匀，在4℃避光保存，此溶液每亳升相当于500ug的亚硝酸钠，作准备液。8.亚硝酸钠标准使用液：临用前，吸取亚硝酸钠标准溶液1.0ml置于100ml容量瓶中，加水稀至刻度，此溶液每毫升相当于5.0ug亚硝酸钠。（三）仪器：小型绞肉机，匀浆器，分光光度计。（四）操作方法1.样品处理：称取约10.0g（粮食取5g）经绞碎混匀的样品，置于匀浆器中，加70ml水和12ml的氢氧化钠溶液，混匀，用氢氧化钠溶液调样品pH=8，定量转移至250ml容量瓶中，加10ml硫酸锌溶液，混匀，如不产生白色沉淀，再补加2-5ml氢氧化钠，混匀，置60℃水浴中加热10min，取出后冷至室温，加水至刻度，混匀。放置0.5h，除去上层脂肪，用滤纸过滤，弃去初滤液20ml，收集滤液备用。2.测定（1）亚硝酸盐标准曲线的制备：吸取0、0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0ml亚硝酸钠标准使用液分别置于25ml具塞比色管中，于标准管中分别加入4.5ml氯化铵缓冲，加2.5ml60%醋酸后，立即加入5.0ml显色剂，加水至零点，于波长550nm处测吸光度，绘制标准曲线，求出回归方程。低含量样品以制备低含量标准曲线计算，标准系列为0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0ml亚硝酸盐标准使用液（相当于0，2，4，8，1.0ug亚硝酸钠）（2）样品测定：吸取10样品滤液于25ml具塞红色管中，其它试剂按标准系列法操作，同时做试剂空白。二、硝酸盐测定（一）原理：样品经沉淀蛋白质，除去脂肪后，溶液通过镉柱，使其中的硝酸根离子还原成亚硝酸根离子，在弱酸性条件下，亚硝酸根与对氨基苯磺酸重氮化后，再与N-1-萘基乙二胺偶合形成红色染料，测得亚硝酸盐总量，由总量减去亚硝酸盐含量即得硝酸盐含量。镉柱每次使用完毕后，应先以25ml盐酸洗涤，再以水洗两次，每次25后用水覆盖镉柱。柱先加25ml氯化铵缓冲液，至液面接近海绵镉时，吸取2ml硝酸钠标准使用液，控制流速，用50ml容量瓶接收，加入5ml氯化铵缓冲液，液面接近海绵镉时，加入15ml水洗柱，还原液和洗涤一并流入50容量瓶中，加60%醋酸，10ml显色剂，加水稀释至刻度，混匀。暗处放置25min，用1cm比色杯，以标准零管调节零点，于波长550nm处测吸光度，根据亚硝酸盐标准溶液计算还原效率（如镉柱还原率小于95％，应经盐酸浸泡活化处理）。3.硝酸盐和亚硝酸盐是食品添加剂中发色剂，添加在制品中后转化为亚硝酸，它极易分解出亚硝基，与肌红蛋白反应生成鲜艳的亮红色的亚硝基血色原，从而赋予食品鲜艳的红色，另外，亚硝酸盐对抑制微生物增殖有一定作用，与食盐并用，可增加抑菌，对肉毒梭状芽孢杆菌有特殊抑制作用。4.亚硝酸盐摄入量过多会对人体产生毒害作用。在pH6.0-7.0从-18-22℃温度范围内，亚硝酸盐与仲胺反应生成亚硝胺，具有致癌作用，已得到公认，另外误食亚硝酸钠为食盐在国内也屡屡发生，过多地摄入亚硝酸盐会引起正常血红蛋白转变为高铁血红蛋白，而失去携氧功能，导致组织缺氧，引起肠原性青紫症。5.硫酸锌溶液，在pH=8.0产生氢氧化锌是蛋白质沉淀剂，这是GB/T5009.33-1996方法和过去GB5009.33-85不同的地方，后者采用亚铁氢化钾和乙酸锌溶液，产生亚铁氰化锌沉淀与蛋白质产生共沉淀，另还应饱和硼砂溶液，也是蛋白