大肠杆菌质粒和噬菌体大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌一般特征大肠杆菌Escherich在1885年发现E、coli,广泛存在于人和温血动物肠道中,44、5℃发酵乳糖产酸产气。最初认为就是非致病菌。20世纪中叶,认识到一些特殊血清型E、coli对人和动物致病,引起严重腹泻和败血症。根据不同生物学特性将致病性大肠杆菌分为6类:肠致病性大肠杆菌(EPEC)肠产毒性大肠杆菌(ETEC)肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)肠出血性大肠杆菌(EHEC)肠黏附性大肠杆菌(EAEC)弥散粘附性大肠杆菌(DAEC)大肠杆菌在分子生物学中得应用大肠杆菌在分子生物学实验中得应用大肠杆菌在分子生物学实验中得应用大家学习辛苦了，还是要坚持加拿大人FrederickBanting和CharlesBest于1921年首先发现胰岛素,1922年开始用于临床,1923年或诺贝尔奖。1965年9月17日,中国科学家第一个在实验室中人工合成了具有全部生物活力得结晶牛胰岛素。人得胰岛素基因在大肠杆菌里指挥着大肠杆菌生产出了人得胰岛素。随着细菌得繁殖,胰岛素基因也一代代传了下去,后代得大肠杆菌也能生产胰岛素。这种带上了人工给予得新得遗传性状得细菌,被称为基因工程菌。大肠杆菌得培养与保存▲准备:取2-5毫升液体LB培养基,到无菌培养管中;▲挑菌:用接种环从培养板上挑取单个菌落,接种到培养基中。要先蘸取少许液体在管壁将菌落研磨开,再轻摇试管使细菌均匀分散到培养基中;▲培养:盖上盖子,保证通气。37℃摇床60rpm,培养过夜;▲转接:1:100转种到培养瓶中,通常250ml培养瓶中加培养液不超过100ml。37℃摇床(250rpm)培养,直至细菌生长到所需密度。将一定数量得细菌,接种于适宜得液体培养基中,在适温下培养,定时取样测数,以菌数得对数为纵坐标,生长时间为横坐标,作出得曲线称为生长曲线。该曲线表明细菌在一定得环境条件下群体生长与繁殖得规律。一般分为延缓期、对数期、稳定期、衰亡期四个时期,各时期得长短同菌种本身特征、培养基成分和培养条件不同而异。◇用接种环蘸取少许细菌培养液,或从固体培养平板得菌落上蘸取少许细菌,从平板得一侧开始划线;◇消毒接种环,从刚划过得部位带过并在旁边继续划线;◇如上重复3～4次,直至划满平板。这样可以确保分离出单个菌落。■在小玻璃瓶或试管中加入三分之二体积得LB半固体培养基;■用接种针从固体培养板上挑取单个菌落,反复刺入琼脂中;■置37℃培养8-12小时,直至可看到细菌生长呈雾状;■拧紧盖子,置15-22℃暗处保存。一般可保存数年;■复苏时用接种环蘸取少许带菌琼脂,划线到LB平板上。■取新鲜饱和得或生长到对数生长中期得细菌培养液,加入灭菌得甘油至终浓度15%(或7%DMSO),混合均匀。■分装到冻存管中,保存在-70℃。如条件所限,亦可保存在-20℃,但保存时间较短。■复苏时,用接种环从上面刮取少许菌液,注意要避免反复冻融。然后划线到LB平板上。质粒(plasmid)就是染色体以外能自主复制得遗传因子不具有胞外期对寄主细胞来说就是非必需得质粒DNA得构型:SC型共价闭合环形DNA(cccDNA)OC型开环DNA(ocDNA)L型线性DNA(LDNA)常见质粒种类:细菌质粒真核生物DNA质粒真核生物RNA质粒质粒概述细菌质粒性质:1、可以在细胞质中独立于染色体之外独立存在(游离态),也可以通过交换掺入染色体上,以附加体(episome)得形式存在;细菌质粒性质:2、质粒就是一种复制子(replicon),根据自我复制能力得不同,可把质粒复制得控制形式分为严紧型和松弛型两种;严紧型质粒得复制受细胞核控制,与染色体DNA复制相伴随,一般一个寄主细胞内只有少数几个(1-5)个拷贝;松弛型质粒得复制不受细胞核控制,在染色体DNA复制停止得情况下仍可以进行复制,在细胞内得数量可以达到10-200个或更多。如果用一定得药物处理抑制寄主蛋白质得合成,会使质粒拷贝数增至几千份。pBR322即属于松弛型质粒,经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。细菌质粒性质:3、可以通过转化(直接吸收摄入)、转导(噬菌体载体)或接合作用(通过细胞间紧密接触而实现遗传物质交换)由一个细胞转移到另一个细胞,使两个细胞都带有质粒;质粒转移时,可以单独转移,也可以携带着染色体(片段)一起转移,所以可成为基因工程载体。细菌质粒性质:4、质粒得不亲合性定义:在没有选择压力得情况下,两种亲源关系密切得不同质粒,不能在同一寄主细胞系中稳定共存。分子基础:主要就是由于复制功能之间相互干扰造成。有相似得复制子结构,受到同一拷贝数控制系统得干扰,使两种质粒最终拷贝数不同,拷贝数多得质粒在以后得分裂中更占优势。ColE1、pMB1;pSC10