红细胞膜蛋白提取鉴定实验分组一.红细胞膜提取制备（低渗法）注意事项：（1）RBC分离：15mlRBC液2000rpm5分钟RBC（沉淀）＋3倍体积等渗磷酸Buffer2000rpm5分钟×2洗净之RBC（2）溶血液制备RBC加入低渗磷酸buffer（>1:50)(在烧杯中）稍搅拌置冰箱冻格（4˚C）溶血过夜（以上步骤已完成！！）二、RBC膜纯化（洗涤）作图：横坐标以标准蛋白含量纵坐标以A620吸光度值图比例应为3:2（横：纵）计算：在标准曲线上查出待测样品的浓度，计算提取膜的Prmg数/ml样品注意稀释倍数要求：计算原提取RBC液的Pr含量五、SDS-PAGE测定膜蛋白分子量（一）垂直板安装每套板两块玻璃下端对齐，夹好，放在胶架上！（二）凝胶制备（见表）先配好分离胶（留距齿梳1cm），待其凝固后，再配浓缩胶。（三）电泳装置安装先装内槽，试无渗漏；放入外槽中，加Buffer。上样品：每孔18ul，2块/组每块板留一标准蛋白孔（四）电泳：100V进分离胶调至80V约1.5小时（五）取胶:用专用板平面轻轻“橇”开板，推入小平皿中。注意：一块半干转移（浸入转移Buffer20min）另一块考马斯亮蓝染色染色2小时后，7%醋酸脱色（×4）每组做好标记（写好名字），交生化室扫描或摄像保留。分子量计算3.半对数图：（六条标准蛋白）（参照统计学散点法）横坐标为迁移率MR纵坐标为LogM（直接按每一蛋白分子量标在半对数图中）4.计算待测样品蛋白质分子量：选在标准蛋白迁移范围内的相应待测样品中的三条带，测量距离计算MR，Mw987654321六、westernblotting(β-actin鉴定)银染