核酸的分离和纯化核酸电泳染色体DNA电泳DNA限制酶切反应和限制酶谱绘制DNA的连接PCR技术分子杂交技术核酸序列的测定第一节核酸的分离和纯化2、载体DNA分离载体DNA感染或转染细胞（病毒型）转化细菌细胞（质粒型）分离病毒颗粒培养转化细胞、收集菌体病毒载体DNA分离与纯化破碎细胞质粒DNA分离与纯化3、DNA片段的分离DNA限制酶切凝胶电泳分离特定DNA片段的回收4、质量评估1）凝胶电泳2）光密度值测定3）限制酶切分析二、细胞裂解1.酶法：利用某些细胞壁裂解酶使细胞变为原生质体，然后加去垢剂使原生质体裂解。1)细菌：溶菌酶2)酵母：蜗牛酶、Novozyme234、glusulase、zymolase等3)丝状真菌：Novozyme234、溶壁酶、纤维素酶4)植物细胞：纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶酶法裂解时要注意细胞的生长条件和生长时间，反应时尽可能满足酶的最佳反应条件。2.机械法1)压力剪切法：French压力机，酵母细胞，细菌（芽孢和G+球菌除外）2)射击破碎法：Braun破碎机，搅切器（blender），混合器（mixer），0.1-0.45mm玻璃球3)固体研磨法：将待破碎细胞与玻璃球（0.1~0.45mm）同时致冷，在未融熔前用研杵磨成粉末4)反复冻融法三、DNA的分离与纯化1、供体DNA的分离与纯化要求：尽可能地保持其高分子量，无其它污染物。1)基因组大小：1)DNA分离纯化过程破碎细胞+DNA抽提液(EDTA、去污剂、还原剂)65℃温育20’冰浴冷却离心去细胞碎片苯酚抽提法①CsCl密度梯度离心②1)苯酚抽提法上清液缓冲液用水饱和苯酚抽提2~3次上层液相用氯仿抽至界面无蛋白变性物上层液相用两倍体积冷乙醇沉淀沉淀物用70%冷乙醇洗涤,干燥溶于缓冲液加入RNAase处理除去RNA苯酚氯仿抽提沉淀干燥2)CsCl密度梯度离心上清液加入固体CsCl与EtBr溶液室温下超速离心(45,000rpm）16小时穿孔取出DNA（320nm）异丙醇抽提溴乙锭缓冲液透析除去残余CsCl两倍体积冷乙醇沉淀DNA离心、洗涤、干燥*两种方法比较：CsCl法操作步骤少，分离DNA分子量大，耗财多，且需超速离心机。苯酚法耗时少，不需昂贵仪器，但操作步骤多，易使DNA分子断裂。若小心操作，所获DNA亦符合要求。**上述两种分离方法都包含了下述四个分离步骤ⅰ.可溶与不可溶物分离：高速离心除去细胞碎片，保留上清液。ⅱ.使蛋白质分离：苯酚抽提或超速离心ⅲ.使RNA分离：RNase处理或超速离心ⅳ.使DNA与其它可溶物分离2.载体DNA的分离与纯化1)质粒载体DNA的分离关键：如何使质粒DNA与宿主染色体DNA分开原理：质粒DNA比染色体DNA小得多，在DNA抽提过程中，染色体DNA断裂成小片段(线状)，质粒DNA仍保持超螺旋构型方法：ⅰ.超速离心：利用两种DNA分子的大小和空间构型ⅱ.变性法：在变性条件下使染色体DNA变为单链，而质粒DNA仍保持环状结构，当变性条件发生迅速变化时，前者仍不能复性，而后者又可回复到天然构型。变性条件可采用加热煮沸法或碱变性法上述方法亦可用于ss环状病毒DNARF型的分离,质粒DNA的氯霉素扩增使用并不广泛（菌株和载体）2)噬菌体载体DNA的分离纯净病毒颗粒病毒载体DNAM13mp载体可采用质粒DNA的分离方法二、RNA的分离与纯化1.制备RNA的关键—防止内外源RNase的作用1)RNase的特点：抗酸抗碱,具很广pH作用范围;抗高温严寒(0~65℃均具活性）；抗变性剂2)解决办法：外源RNase—高温，焦磷酸二乙酯(DEPC)处理所有溶液（Tris·HCl除外）和器皿，操作者带手套内源RNase—高温抽提，强蛋白质变性剂，RNase抑制剂，蛋白酶K等2.总RNA的制备根据所用蛋白质变性剂种类不一样分为以下三种制备方法：1）热苯酚抽提法2）胍盐法：异硫氰酸胍和硫氰酸胍3）LiCl/尿素法其中以胍盐法最好，对于从那些RNase含量很高的组织（胰脏）中提取RNA特别有效，可使RNase迅速变性，制备的RNA有较高翻译活性。在RNA制备中，细胞破碎与蛋白质变性是同步进行的。i.结合与游离核糖体的分离，这种方法可避免溶酶体破裂。ii.核糖体大小分级分离，利用连续密度梯度分离特大和特小的多聚核糖体iii.核糖体免疫沉淀法*直接免疫沉淀法新生肽链+抗体蔗糖密度梯度离心**间接免疫沉淀法新生肽链+抗体+抗-抗体（二抗）不可溶复合物离心分离***免疫亲和层析法新生肽链-抗体复合物不溶性交联抗原基质亲和层析柱吸附洗脱免疫沉淀法优点：可分离到含量仅为1%的mRNA，