实验一植物细胞培养基的种类及配制一、实验目的1、了解植物细胞培养基的种类及营养要求。2、掌握MS培养基的配制方法。二、实验材料1、实验设备：高压灭菌锅、电子分析天平、pH计、超净工作台。2、实验器材：电磁炉、烧杯、量筒、搅拌棒、吸量管、移样枪。三、植物细胞培养基的种类在100多年的植物组织、器官和细胞离体培养研究中，研制开发了数十种适宜不同植物、不同组织、不同细胞生长发育的培养基配方，但多数培养基是在几种普遍应用的培养基上演变而来的，其中应用最为广泛的仍为MS培养基。植物组织培养基早期的建立，如White提出的根培养基和Gautheret提出的愈伤组织培养基，都是由先前的用于整体植物栽培的营养液发展而来的。以后所有的各种培养基又都是在White培养基和Gautheret培养基的基础上形成的。各种培养基在无机营养组成上的差异主要是盐和离子数量上的不同。常用培养基中根据无机盐的含量可以分为4类，分述于下：1、高无机盐含量培养基：高无机盐含量培养基中，钾盐、铵盐及硝酸盐含量较高，微量元素种类齐全，养分数量及比例较合适，广泛用于植物的器官、花药、细胞及原生质体的培养。主要有MS培养基和ER培养基。2、较高硝酸钾含量培养基：较高硝酸钾含量培养基适合于木本植物、十字花科植物和单子叶植物的组织和花药培养。主要有B5培养基和N6培养基。3、中等无机盐含量培养基：中等无机盐含量培养基中，大量元素约为MS培养基的一半，微量元素种类减少，但含量较MS的高，适合于花药培养。主要有Nitsch培养基和NT培养基。4、低无机盐含量培养基：低无机盐量培养基中，大量元素含量大幅降低而且种类减少，多数用于生根培养基。主要有White培养基和Heller培养基。各种植物培养基的营养组成及配方如下表：培养基成分四、MS培养基的配制植物细胞培养基种类很多，如MS、ER、B5、N6、NT和White等。本实验以MS完全培养基为例，介绍植物细胞培养基的配制方法。（一）MS培养基母液的配制母液的配制是按药品的种类和性质分别配制，单独保存或几种混合保存。配制好的母液种类一般有大量元素、微量元素、钙盐、铁盐、有机营养和单独保存的各种生长调节类物质。大量元素一般配制成10倍浓度的母液，微量元素和有机物常配制成100倍浓度的母液。见下表。母液上表提供了MS培养基母液的配方。将各种化合物按指定扩大倍数准确称量、分别溶解后，按先后次序加入蒸馏水中，最后用蒸馏水定容。注意：在混合定容时，一定要掌握药剂的先后次序或稀释度，以免发生沉淀。钙盐和铁盐由于与其它母液混合容易发生沉淀反应，因此需单独配制。铁盐为螯合状态时，有利于植物在适宜的pH下吸收和利用，因此需与螯合剂Na2·EDTA混合配制。生长调节类物质一般分别配制成0.2~1.0mg/L的母液，用时按量吸取。某些生长调节剂不溶于水，需用不同溶剂进行溶解，如NAA、2,4-D、IAA、IBA、GA3是醇溶性的，配制时先用少量95%酒精溶解，然后再用蒸馏水定溶；KT、6-BA、2ip、ZT先溶于少量1mol/L盐酸中，然后再用蒸馏水定容；叶酸先用少量稀氨水溶解后再定容。配制好的各种母液倒入棕色瓶中，贴好标签，保存于4℃冰箱中备用。注意：母液保存于冰箱中的时间不宜过长，一般为1~2个月，当母液出现沉淀或霉菌团时，则不能再使用。（二）MS完全培养基的配制以配制1000mLMS完全培养基为例，配制全过程如下：1、在洁净的不锈钢（或搪瓷）容器中加入1/2终体积（500mL）的蒸馏水；2、按上表内容规定的量，精确吸取各种母液，依次加入到盛有1/2终体积蒸馏水的不锈钢（或搪瓷）容器中，记录此时的总体积。注意：母液不能混合后加入，也不能同时加入，必须依次缓慢加入，且要一边加入一边搅拌，以免造成电解质局部浓度过高而发生沉淀反应；3、根据培养目的及要求，加入所需量的各种生长调节物质，记录此时的总体积（如用于长春花叶愈伤组织的诱导：加入2,4-D1.0mg/L、6-BA0.5mg/L、NAA1.0mg/L、KT0.2mg/L）；4、加入30g蔗糖，5g聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP，抗氧化剂，防止或减轻植物组织褐化，也可用一定量的维生素C、活性碳代替，或不加，视情况而定），充分混匀后，补充蒸馏水至终体积1000mL，然后用1mol/L盐酸或1mol/L氢氧化钠调节培养基至pH5.8；5、精确称取15g琼脂加入其中，在电磁炉上煮沸溶解琼脂。此过程需加以搅拌，防止琼脂在锅底烧焦或沸腾溢出；6、琼脂溶解后，及时将培养基分装于150mL三角瓶中，约50mL/瓶，包膜密封，并于100KPa、121℃下灭菌15~20分钟。冷却备用。注意：培养基的pH直接影响培养