糖连接位置的测定（五）糖链连接顺序的决定1、经典方法：部分水解法※过程：多糖→部分水解→低聚糖→分析低聚糖连接顺序→推测糖链连接顺序2、驰豫时间法※基本原理：外侧糖的自旋晶格驰豫时间T1比内侧大，同一糖上各碳的自旋晶格驰豫时间T1则基本相同。（六）苷键构型及氧环的确定1、苷键构型测定方法如下：⑴.分子旋光差法（klyne法）⑵.酶催化水解方法例如：麦芽糖酶只能水解α-苷键；苦杏仁酶只能水解β-苷键等。⑷13C-NMR判断糖苷键的构型通过C1-H1偶合常数来判断苷键的构型.例如：D-葡萄吡喃甲苷，α-苷键：JC1-H1=170Hzβ-苷键：JC1-H1=160Hz3、糖氧环大小的测定①根据13CNMR数据来判断例如：吡喃糖环中13C3-NMR信号在72-78ppm;呋喃糖环中13C3-NMR信号在80ppm以上。②分析Smith降解产物也可判断氧环的大小。③利用甲醇解反应来判断呋喃型糖甲苷与吡喃型糖甲苷色谱行为不同。二、糖链结构研究实例——皂角苷A的结构测定1、皂角苷A为无定形粉末，是九糖三萜皂苷。2、HR-FAB-MS负离子源测得分子量为：1831.7649[M-H]-3、结合13CNMR、DEPT谱确定皂角苷A分子式为：C82H128O458、薄层酸水解后，与标准品对照证明皂角苷A中尚含有另一个单糖——葡萄糖醛酸。9、将酸水解后所得苷元再经过各种波谱数据对照证明，确认该苷元为皂树皂苷元。10、ESI-MS谱图数据①m/z1699(M--H-132)提示：木糖(M=150，150-16-2=132)为末端糖；②m/z=955峰提示：脱掉了是一个六碳糖，在C3或C16位上连接的是一个由葡萄糖醛酸、半乳糖及木糖组成的三糖。11、对所有13CNMR、1HNMR信号进行归属（很复杂！）①归属的依据：1HNMR、13CNMR及其1H-1HCOSY,1H-13CCOSY、NOESY等。②从表2-4可看到：A、有两个木糖E、F的端基质子化学位移值完全一样，表示这两个氢信号重叠在一起。B、有一个木糖H与鸡纳糖的端基质子化学位移值完全一样，表示这两个氢信号也重叠在一起。12、通过HMBC（异核多键相关）谱确定糖与糖的连接关系13、根据1JC1-H1、C1-H与C2-H偶合常数以及C1的化学位移值确定苷键的构型。③在被苷化的糖分子结构中，通常与端基碳直接相连的α-C的化学位移变化较大些，β-C稍受影响，其他碳原子受到的影响则较少。④在确定了苷中糖的种类以后，将苷的13C谱数据与相应单糖的13C谱数据进行比较，利用苷化位移规律可确定苷中糖的连接位置。例如：判断双糖苷中两单糖的连接位置◆将双糖苷的13C谱数据与相应单糖的13C谱数据进行比较；◆如果内侧糖的某个碳原子的化学位移向低场方向移动了（通常是4~7ppm),而与其相邻的两个碳原子之化学位移值又略向高场方向移动（约1~2ppm),则内侧糖的这个碳原子就是糖的连接位置。三、红外光谱IR4、软电离方式得到的碎片峰很少，但有可能获得从分子离子峰按顺序失去一个个糖基后的碎片离子峰。如果事先测定了多糖的组成，则可根据质谱的碎片离子峰信息来推断原糖链的连接顺序。※时间：30-120min※显色剂：p-甲氧基苯胺-硫酸。※注意：必须使用冷却系统，将温度维持在0℃,以免烧坏支持体。※本法常用2、超离心法※原理：由于微粒在离心力场中移动的速度与微粒的密度、大小与形状有关，故将多糖3、旋光光度法在多糖水溶液中加入乙醇使其浓度达到10%左右，离心得沉淀。上清液再用乙醇使其浓度达到20%-25%左右，离心得到第二次沉淀。比较两次沉淀的比旋光度，如果比旋光度相同则为纯品，否则为混合物。4、其他方法如凝胶柱色谱、官能团摩尔比恒定法等。（二）分子量测定1、测定多糖分子量物理方法：沉降法、光散射法、黏度法和渗透压法等。2、凝胶过滤法简介：在凝胶柱上不同分子量的多糖与洗脱体积成一定的关系。采用一系列结构相似的已知分子量的多糖做标准曲线，进而测定样品多糖的分子量。◆该法用量小、操作较简便。3、单糖、低聚糖及其苷分子量的测定※最常用FD-MS、FAB-MS与电喷雾-MS4、多糖分子量的测定方法①基质辅助激光解析电离质谱（MALDI-MS）②基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS).（三）单糖的鉴定1．纸层析①展开系统：常用水饱和的有机溶剂如：正丁醇：醋酸：水（4：1：5上层）BAW正丁醇：乙醇：水（4：1：2.2）BEW②展开方式：上行、下行等③显色剂：可利用糖的还原性或形成糠醛后引起的一些呈色反应。例如，※邻苯二甲酸苯胺※硝酸银试剂（使