【PCR原理】聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)是一种选择性体外扩增DNA的方法，其基本原理类似于DNA的天然复制过程。反应包括:变性(Denature)、退火(Anneal)和延伸(Extension)三个基本步骤。这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经25～35轮循环就可使DNA扩增达106倍。加热PCR扩增原理变性：加热，使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。退火：溶液温度降至45～65℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，即退火阶段。延伸：溶液反应温度升至72℃，耐热DNA聚合酶以单链为模板，利用引物的3’-OH，以反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP）为底物，按5’－3’方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。温度（℃）PCR的产量【仪器耗材与试剂】（一）仪器与耗材1.PCR热循环仪2.20μL、200μL吸头，200μL、500μLEP管，10μL、50μL、200μL移液器3.PCR电泳仪和电泳槽（二）试剂10×PCRBuffer；MgCl2,25mmol/L；dNTP（其中包括dATP、dCTP、dGTP与dTTP；每种浓度均为10mmol/L）；正向引物与反向引物（10μM/L）；TaqDNA聚合酶（1U/μL）；DNA模板（小鼠基因组DNA，100ng/μL，反转录cDNA）；ddH2O【实验步骤】1.在0.2mLEppendorff管内配置20μL反应体系：2.按下述程序进行PCR扩增:1）94℃预变性3min；2）94℃变性1min；3）55℃退火30sec；4）72℃延伸30sec；5）重复步骤2~4,34次；6）72℃延伸5min；7）4℃,3min.3.琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果配制2％琼脂糖凝胶，取10μL扩增产物电泳。保持电压100V。电泳结束后，在紫外灯下观察结果。4.PCR的反应体系中各组分作用质量：要求有较高纯度的DNA样品避免反复冻融，防止降解数量:25-100ng/20µl2）引物3）dNTP最初的聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶klenow片段,不耐热，每次加热变性后需重新补加。聚合温度偏低（37℃），产生非特异性扩增TaqDNA聚合酶从水生栖热菌中分离，可在70-75℃生长。作用:增强酶蛋白的稳定性，维持酶活性。增加dsDNA的Tm值，提高融合温度。与游离dNTP形成可溶性复合物，有利dNTP渗入。浓度:1.5-2.0mmol/l5.PCR反应常见问题2.产生多个条带：引物与非目的片段存在互补，或者浓度太高Mg2+浓度太高酶用量太多退火温度过低等3.产生与目的片段长度相似的非目的片段:模板或者试剂不纯，有其他基因组污染4.出现片状拖带：模板，酶，dNTP用量太大，循环次数过多谢谢！