食品卫生微生物学检验菌落总数测定菌落总数测定卫生学意义：菌落总数主要作为判定样品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察样品中细菌的性质和繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学综合评价时提供科学依据。主要修订内容第一法平板计数法培养基改变情况样品处理添加了拍打式均质器或等效的设备菌落总数的检验程序图样品的稀释用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。按上述操作制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管或吸头。根据对样品污染状况的估计，选择2～3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，每个稀释度分别吸取1mL样品匀液于2个无菌平皿内。同时分别取1mL稀释液加入2个无菌平皿作空白对照。及时将15mL～20mL冷却至46℃的平板计数琼脂培养基(可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温)倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4mL）。培养菌落计数其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。平板内如有链状菌落生长时(菌落之间无明显界线)，则应将每条链（不同来源）作为一个菌落计。结果的表述-菌落总数的计算方法若所有稀释度的平板上菌落数均大于300，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。若所有稀释度的平板上菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。若所有稀释度的平板菌落数均不在30~300之间，其中一部分大于300或小于30时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数计算。菌落总数的报告菌落总数计算公式的改变计算公式计算范例检样稀释：检样稀释时，应以无菌操作称取或量取有代表性在样品25g（25mL）置225mL灭菌稀释液中。固体样品应剪碎，以拍打式样品处理器做成样品悬液（1：10）。根据食品卫生标准和对样品污染情况的估计，再进行10倍递增稀释。注意每递增稀释一次，必须另换1支吸管，以保证样品稀释倍数的准确性。从吸管筒内取出灭菌吸管时，注意不要将管尖碰到手或其他沾污物可能触及的部位。（如玻璃瓶口、试管品、仍留在容器内的吸管的外露部分）。进行稀释时应注意取样的准确性。（如：吸入液体时应先高于吸管刻度，然后提起吸管尖端离开液面，将液体放至所需刻度。放液体时，不要让吸管接触稀释液的液面，可沿管壁放入，避免吸管外粘附的食品残渣进入稀释液体中）。平板接种与培养：根据食品卫生标准要求和对样品污染情况的估计，选择2~3个稀释度。加入样品时要注意外来的污染。培养基倾注的温度与厚度是实验正确与否的关键。（倾注的温度：一般35~45℃，温度过高会造成已受损伤的菌细胞死亡。厚度：直径9cm的平皿一般要求15~20mL培养基，若培养基太薄，在培养过程中可能因水分蒸发而影响细菌的生长）。为防止细菌增殖及产生片状菌落，在加入样液后，应在20min内倾注培养基。检样与培养基混匀时，可先向一个方向旋转，然后再向相反方向旋转。旋转中应防止混合物溅到皿边的上方。培养基凝固后，应尽快将平皿翻转培养，保持琼脂表面干燥，尽量避免菌落蔓延生长，影响计数。为控制污染，在实验过程中，应在工作台上打开一块琼脂平板，其暴露时间应与检样从制备、稀释到加入平皿时所暴露的最长时间相当，然后与检样一同培养，以了解检样在操作过程中有无受到来自外界的污染。培养温度:每种不同样品中的细菌都有一定的生理特性，培养时应用不同的营养条件及生理条件可能得出不同的结果，因而应根据检测标准的要求选择适当的培养温度和培养时间。食品：36±１℃，48±2h。饮用水：36±１℃，48h。水产品：30±１℃，72±3h。(36℃培养和30℃培养结果差别较大，同样水产品48h结果和72h也有差别。)对照试验：检样的稀释液中往往带有食品颗粒，在这种情况下，为避免与细菌菌落混淆，可作一检样对照，不经培养，置4℃环境放置，在计数时用于对照。或可选用TTC营养琼脂作培养基。菌落计数：如果高稀释度平板上的菌落数比低稀释度平板上的菌落数高，则说明检验过程中可能出现差错或样品中含抑菌物质，这样的结果不可用于结果报告。如果平板上出现链状菌落，菌落间没有明显的界限，这可能是