食品微生物（菌落总数、大肠菌群）的测定一、灭菌前的准备A、平板计数琼脂培养基的配制用电子天平称取2.5g营养琼脂培养基于500ml三角烧瓶中，加入100ml蒸馏水，摇匀，塞好棉花塞，并包上一层牛皮纸，系上绳子扎紧。B、月桂肉汤发酵管（双料）的配制用电子天平称取7.2g月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）发酵培养基于500ml三角烧瓶中，加入100ml蒸馏水，用玻璃棒搅拌溶解均匀，用10ml吸量管吸取10ml放入18*18的试管中，每支试管装10ml，共10支试管，每支试管放入一个小倒管，倒摇排气后，塞好棉花塞。C、取一支洁净的试管，用10ml吸量管吸取9ml无菌生理盐水放入其中，塞好棉花塞。D、取洁净干燥的培养皿6套，用报纸包成一筒。E、取洁净干燥的10ml吸量管5支，粗端塞入少量脱脂棉，每支吸量管用宽约4到5cm的纸条以45度左右的角度裹卷起来，包好。F、取一个洁净的500ml三角烧瓶，用量筒取225ml无菌生理盐水，塞好棉花塞，并包上一层牛皮纸，系上绳子扎紧。二、灭菌1、加水：取出高压灭菌锅的内桶，再向外层锅内加入适量的蒸馏水，使水面与三角搁架相平为宜。2、放灭菌物品：将内桶放回灭菌锅内，并将上述6项一起放入高压灭菌锅内桶。3、加盖密封：将盖上的排气软管插入内层灭菌桶内的排气槽内，再以亮亮对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，使器盖与主体密和。4、加热：插入电源，关闭安全阀并同时打开放气阀，待到水沸腾后出气3到5min，以排尽锅内的冷空气，关闭放气阀，此时压力表指针朝顺时针方向缓动，显示灭菌锅的压力正在逐渐上升，同时温度随着升高。5、灭菌：当锅内压力升到所需压力（0.15MPa）时，切断电源，待压力表指针缓缓降到0.1Mpa时，再通上电源，待锅内压力上升到所需压力（0.15MPa）时，切断电源，待压力表指针缓缓降到0.1Mpa时，再通上电源，待锅内压力上升到所需压力，共重复三次。最后一次切断电源后，等压力表指针降为0时，再打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品，及时放入无菌室。三、接种1、无菌室在使用之前，先开启紫外光15min，在进入无菌室之前要关闭紫外灯。2、用沾有75%酒精的棉球擦洗双手。3、注意控制操作温度：A项平板计数琼脂培养基要保温在46℃左右（可将平板计数琼脂培养基放在高压灭菌锅中，待要用时再取出。），其余各样均要控制在室温。4、接种：（1）用电子天平取25g样品，用剪刀剪碎，放入装有225ml无菌生理盐水的三角烧瓶中，充分振摇成10-1（即1：10）的均匀稀释液。（2）取3支10ml月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）发酵培养基试管，各加入10ml10-1均匀稀释液，做好标记。（3）另取3支10ml月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）发酵培养基试管，各加入1ml10-1均匀稀释液，做好标记。再取2个灭菌培养皿，各加入1ml10-1均匀稀释液，做好标。（4）往装有9ml灭菌生理盐水的试管中加入1ml10-1均匀稀释液，充分振摇成10-2（即1：100）的均匀稀释液。（5）取3支10ml月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）发酵培养基试管，各加入1ml10-2均匀稀释液，做好标记。再取2个灭菌培养皿，各加入1ml10-2均匀稀释液，做好标。注：接种过程最好在酒精灯旁边操作；接种时培养皿只能打开一个小口，移液管能够伸进去或用三角烧瓶可以往里倒培养基即可；在每一次操作完时应及时将棉花塞塞好。四、培养待琼脂凝固后，将平板翻转，开启微生物培养箱，把接种好的培养皿、月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）发酵管放入培养箱培养。培养温度：36±1℃培养时间：①菌落总数测定：48±2h（水产品：培养温度30±1℃，培养时间72±1h）。②大肠菌群测定：24±2h，产气着进行复发酵试验；未产气着则继续培养至48±2h，产气着进行复发酵试验。五、结果1、菌落计数：可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数其，记录稀释倍数和相应的菌落数量。选取菌落数在30CFU至300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。2、大肠菌群判断：观察是否有气泡产生，未产气者为大肠菌群阴性，产气着可认为该产品不合格。大肠菌群最可能数按确认的达产菌群LST阳性管数，检索MPN表。