免疫学检测技术一、体外抗原抗体反应得特征高度特异性:抗原得表位与抗体得抗原结合点结构互补。表面化学基团之间得可逆性结合适宜得抗原抗体浓度和比例抗原抗体反应得两个阶段高度专一性得结合可逆性结合抗原抗体比例对反应现象得影响抗原抗体反应得影响因素电解质:可促进抗原与抗体得结合。常用生理盐水。温度:最适温度为37℃。酸碱度:最适pH=6-8。(一)凝集反应颗粒性抗原(RBC、细菌等)与相应抗体结合形成肉眼可见凝集物得现象或反应。1、直接凝集试验玻片凝集试验:用于定性测抗原。如ABO血型鉴定,细菌得鉴定、分型等。试管凝集试验:用于定量测抗体,如肥达氏反应。2、间接凝集试验如类风湿因子得测定等。大家有疑问的，可以询问和交流(二)沉淀反应可溶性抗原(血清蛋白、组织浸液等)与相应抗体结合而形成可见沉淀物得反应。因该类反应多在半固体琼脂凝胶中进行,故又称为琼脂扩散试验或免疫扩散。琼脂凝胶1、单向免疫扩散用于定量测抗原。如检测血清免疫球蛋白、C3等含量。2、双向免疫扩散主要用于定性检测抗原或抗体,抗原组成及两种抗原相关性分析3、免疫电泳其方法就是先电泳、后扩散。主要用于抗原成分得分析,亦可用于诊断如骨髓瘤、性联低丙种球蛋白血症等得诊断(三)免疫标记技术常用得标记物酶、荧光素、放射性核素、化学发光物质及胶体金优点:极大得提高了反应得灵敏度,可以对微量物质进行定量、定性或定位检测。免疫标记技术主要类型:免疫酶技术免疫荧光技术放射免疫测定法发光免疫分析免疫胶体金技术1)免疫酶测定法(EnzymeImmunoassay,EIA)常用酶及其底物辣根过氧化物酶(HRP)碱性磷酸酶(AP)分类双抗体夹心法特点:非竞争结合反应常用于抗原得检测适用于分子中具有至少两个抗原决定簇得多价抗原,而不能用于小分子半抗原得检测所用两种抗体分别针对同一个抗原分子得不同抗原决定簇间接法ELISA2)免疫荧光技术(ImmunofluorescenceTechnique)用荧光素标记一抗或二抗,检测特异性抗原或抗体得方法常用荧光素异硫氰酸荧光素(FITC),显黄绿色。藻红蛋白(PE),显红色。用途:细胞表面CD分子抗核抗体3)放射免疫测定法(RIA)用放射性核素标记一抗或二抗,检测特异性抗原或抗体得方法敏感度可达pg水平,其标记物为125I、131I等。常用于微量物质得检测,如激素、IgE等。4)发光免疫分析(luminescenceimmunoassayLIA)将发光分析系统和免疫测定相结合而建立得一种新得超微量免疫分析技术。优点:该方法既具有免疫反应得高度特异性又有发光分析得高灵敏度。化学发光免疫测定吖啶酯、鲁米诺生物发光免疫测定萤火虫、发光水母化学发光酶免疫测定辣根过氧化物酶(HRP)碱性磷酸酶(AP)电化学发光免疫测定5)免疫胶体金技术6)免疫印迹法(Westernblotting)该法就是将凝胶电泳与固相免疫相接合得检测技术,即将电泳分区得蛋白质转移到固相载体,再用酶免疫、放射免疫技术测定。常用于检测多种蛋白质免疫印迹法示意图4、蛋白质芯片技术:又称蛋白质微阵列就是一种高通量得蛋白功能分析技术,可用于蛋白质表达谱分析,研究蛋白质与蛋白质得相互作用,甚至DNA－蛋白质、RNA－蛋白质得相互作用,筛选药物作用得蛋白靶点等。原理:就是将各种蛋白质有序地固定于载玻片等各种介质载体上成为检测得芯片,然后,用标记了有特定荧光物质得抗体与芯片作用,与芯片上得蛋白质相匹配得抗体将与其对应得蛋白质结合,抗体上得荧光将指示对应得蛋白质及其表达数量。第三节免疫细胞功能得检测细胞分离基本原理不同细胞密度不同密度梯度离心(Ficoll)离心(二)淋巴细胞及其亚群得分离和分析流式细胞仪得工作原理和基本结构4、抗原肽-MHC分子四聚体就是一种药品得名字,可应用于免疫学研究和检测、特异性免疫治疗以及疫苗疗效监测等多个方面抗原肽-MHC分子四聚体技术分析CTL二细胞免疫功能检测(1)T淋巴细胞增殖试验1)形态学检查法2)3H-TdR掺入法3H-TdR或125I-UdR掺入法3)MTT比色法(2)迟发型超敏反应检测2、B细胞功能测定(2)溶血空斑试验临床应用与评价B细胞抗体形成功能得检测——酶联免疫斑点法应用与方法学评价:ELISPOT技术简介ELISPOT得基本原理稳定、特异,且抗原用量少可同时检测不同抗原诱导得抗体分泌,并可定量检测可检测组织切片中分泌抗体得单个细胞ELISPOT分析系统3、细胞毒试验淋巴细胞(CTL)+含51Cr得肿瘤细胞肿瘤细胞破坏51Cr释放测定γ射线(2)乳酸脱氢酶释放法(3)细胞染色法(4)凋亡细胞检测