一．外周血淋巴细胞RNA提取外周血淋巴细胞分离提取：10ml人外周血血样（EDTA-2K抗凝管采集）稀释血样：D’Hanks以1:1稀释加入淋巴细胞分离液（稀释血样：淋巴细胞分离液=2:1）室温，2000rpm/min离心20min吸取单个核细胞层D’Hanks洗涤细胞1500rpm/min离心10minD’Hanks洗涤细胞1000rpm/min离心10min收集淋巴细胞沉淀（细胞计数：约1×107个细胞）外周血淋巴细胞RNA提取：1×107个淋巴细胞中加入1mlTriZol，4℃静置5min，裂解加入200ul氯仿，上下颠倒至溶液出现浆白色，无分相现象置于冰上5min；4℃，12000rpm/min，离心15min将上层水相移入另一离心管，加等体积异丙醇，冰上孵育10min4℃，12000rpm/min，离心10min弃上清，在沉淀（含RNA）中加1ml75%乙醇洗涤4℃，12000rpm/min，离心5min，得到RNA沉淀；空气干燥后，用适量TE或无RNase水溶解备用RNA浓度：1400μg/μl，OD260/OD280=2.00淋巴细胞分离液：上海华精生物高科技有限公司标准号：Q/GHSB85-2001批号：040524二．1st-StrandcDNA合成反应：1.在Microtube中配制下列混合液试剂使用量OligodTPrimer(50μM)1μldNTPMixture(10mMeach)1μl模板RNATotalRNA：5μg以下（4μl）RNaseFreedH2OUpto10μl2.65℃保温5min后，冰上迅速冷却。3.在上述Microtube中配制下列反转录反应液，总量为20μl。试剂使用量上述变性后反应液10μl5×PrimerScriptⅡBuffer4μlRNaseInhibitor(40U/μl)0.5μl(20U)PrimerScriptⅡRTase(200U/μl)1μl(200U)RNaseFreedH2OUpto20μl4.缓慢混匀。5.按下列条件进行反转录反应：42℃30-60min，95℃5min，冰上冷却。以PET28a为载体表达产物N端带有可以被thrombin酶切的组氨酸标签，上游primer：5’-GGAATTCCATATGACCTGCTGCAGTCTACAC-3’(NdeI酶切位点以及保护碱基)下游primer：5’-CCGCTCGAGTTAAAATTTTAATAGCTAGTCTTCG-3’(XhoI酶切位点以及终止密码子、保护碱基)