限制性核酸内切酶消化DNA一、实验目的二、实验原理EcoRⅠ质粒是细菌细胞内独立于染色体之外能自主复制的双链环状DNA分子。本实验用到的是pGEM-TEasy质粒。凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。质粒有3种构型：1、超螺旋的共价闭合环状质粒DNA；2、开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA1条链断裂；3、线状质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA2条链发生断裂。这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同,因此电泳后呈3条带。超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA和开环质粒DNA。EcoRⅠ或HindⅢ可以将pGEM-TEasy质粒DNA切开成为线性DNA。用未经酶切的pUC质粒DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，就可以推测酶切是否成功。三、仪器与试剂四、实验步骤质粒酶切电泳图六、注意事项六、注意事项六、注意事项4、反应缓冲液的影响反应缓冲液主要由Tris·HCl、NaCl、Mg2+组成，其中Mg2+为内切酶辅基；Tris·HCl维持反应体系pH值在7.2-7.6之间；NaCl浓度不同形成３种级别的离子强度：低盐（10mMNaCl)中盐（50mMNaCl）高盐（100mMNaCl）不同的内切酶选择特定的反应缓冲液。5、酶切消化反应的温度：DNA消化反应的温度，是影响限制内切酶活性的一个重要因素。不同的核酸内切限制酶，具有各自的最适反应温度。多数限制内切酶的最适反应温度是37℃，少数限制性内切酶的最适反应温度高于或低于37℃。6、酶切消化反应的时间：反应时间根据酶的单位与DNA用量之比来定，原则是DNA:酶=２-３:１。本实验1小时即可充分酶解。7、限制性内切酶反应的终止，通常有以下两种方法：（1）采用65℃条件下温浴20min，通过加热失活内切酶；（2）加终止反应液（如0.5mol/L的EDTA使之在溶液中的终浓度达到10mmol/L）螯合内切酶的辅助因子Mg2+使内切酶变性以终止反应.谢谢各位