参照2012-XX-XX定稿GB/T13092-2006饲料中霉菌总数测定方法编制人审核人批准人霉菌总数检测操作规程1原理根据霉菌生理特性，选择适宜霉菌生长而不适宜细菌生长的培养基，采用平板计数法测定霉菌总数。2试剂与仪器2.1所用器具三角烧瓶、玻璃珠、具塞试管、培养皿、1000μL枪头、5mL枪头、称量勺、接种环、接种针、移液器2.2仪器：分析天平、恒温培养箱、微型振荡器、超净工作台、高压灭菌锅2.3所用试剂和培养基高盐察氏培养基取高盐察氏培养基109g，加入蒸馏水1L，搅拌加热至完全溶解，分装三角瓶，115℃高压灭菌30min，备用。3、操作步骤3.1配制0.85%生理盐水称取氯化钠8.5g溶于1000mL蒸馏水中。3.2锥形瓶加入生理盐水90mL，试管中加入生理盐水9mL，121℃灭菌30min。（三角烧瓶个数与样品数量一致，试管数量与稀释次数相关）。3.3将1000μL枪头、培养皿、5mL枪头、称量勺、带6颗玻璃珠具塞试管，121℃灭菌30min。（注意计算数量）3.4枪头、培养皿置于烘箱103℃烘干。（1-3步需提前一天完成）3.5对称量房间进行紫外灭菌30分钟，关灯静置60min。以无菌操作取样品10g于含90mL生理盐水三角烧瓶中，于振荡器上振荡30min，制成1:10的均匀稀释液。3.6吸取1:10稀释液10mL注入带玻璃珠的试管，置微型混合器上混合3min。3.7用1000μL枪头吸取1:10稀释液1mL，沿管壁慢慢注入含有灭菌生理盐水9mL的试管中，于振荡器上混合均匀，制成1:100的均匀稀释液。3.8另取一只1mL灭菌吸管，按照上述操作方法，作10倍递增稀释，如此每递增稀释一1参照2012-XX-XX定稿GB/T13092-2006饲料中霉菌总数测定方法编制人审核人批准人次，更换一支灭菌吸头。3.9选择3个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，吸取该稀释的吸管移1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个培养皿。3.10稀释液移入培养皿后，及时将凉至46℃±1℃的高盐察氏培养基（可放置46℃±1℃水浴锅内保温）注入培养皿约15mL，小心转动培养皿使试样与培养基充分混匀。3.11待琼脂凝固后，倒置平皿于28℃±1℃恒温培养箱内培养3天后开始观察，培养观察一周。计算平板内菌落总数目，菌落总数乘以稀释倍数，即得每克试样所含霉菌总数。4霉菌总数计算方法做平板菌落计数时，可用肉眼观察，如菌落形态较小可借助放大镜观察。在计算出各平板菌落总数后，求出同稀释度的两个平板菌落的平均值。4.1霉菌总数的报告形式菌落总数在100以内时，按其实有数报告，大于100时，采用两位有效数字，在两位有效数字后面的数值，以四舍五入方法修约。为了缩短数字后面的零数，也可以用10的指数表示。（见表1）4.2霉菌总数计数的报告4.2.1平板霉菌总数的选择选择菌落总数在10~100之间的平板进行霉菌总数测定，每一稀释度使用两个平板菌落的平均数。两个平板其中一个平板有较大片状菌落生长时不宜采用；若片状菌落不到平板的一半，而另一半菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2以代表全平皿霉菌总数。4.2.2稀释度的选择①应选择平均菌落总数在10~100之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之（见表1中例次1）②若有两个稀释度，其生长的菌落总数均在10~100之间，则视两者之比如何来决定。若其比值（高稀释度数值：低稀释度数值）≤2，应报告其平均值；若＞2则报告其中较小的数字（见表1中例次2及例次3）。③若所有稀释度的平均菌落总数均大于100，则应按稀释度最高的平均菌落总数乘以稀释倍数报告之（见表1中例次4）。④若所有稀释度的平均菌落总数均小于10，则应按稀释度最低的平均菌落总数乘以稀释倍数报告之（见表1中例次5）。2参照2012-XX-XX定稿GB/T13092-2006饲料中霉菌总数测定方法编制人审核人批准人⑤若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释度报告之（见表1中例次6）。⑥若所有稀释度的平均菌落总数均不在10~100之间，其中一部分＞100，或者小于10时，则以最接近10或100的平均菌落总数乘以稀释倍数报告之（见表1中例次7）。表1稀释度选择及菌落总数报告方式例稀释液及菌落总数稀释液霉菌总数报告方式稀释度选择次10-110-210-3之比/[CFU/g（mL）]/[CFU/g（mL）]多不取平均菌落总数在10~100之间1808—80008.0×103可计的稀释度多不10~100之间，比值（12000：8700）287121.4103501.0×104