实验诊断课件教学第十章其他检测第一节基因诊断第二节流式细胞术及其临床应用第三节染色体检查第一节基因诊断可是内源性基因、先天遗传性疾患、后天基因突变引起的疾病，包括法医物证的DNA指纹、个体识别。亲子关系识别等。一般侵入体内的病原生物可通过显微镜检查和免疫学方法进行诊断，直接检测病原生物的遗传物质可以大大提高诊断的敏感性。基因诊断的主要内容⑴基因突变检测：点突变、基因片段的缺失与插入、基因重排。⑵基因连锁分析：⑶基因表达分析：如mRNA定量检测及mRNA长度分析.⑷病原体诊断：即外来入侵病原微生物遗传物质的检测.二、基因诊断在诊断学中的位置传统的疾病诊断方法主要是以疾病表形改变为依据，如症状、体征、物理检查、实验室检查。然而表形的改变在许多情况下不是特异的，同一种表形可能在多种疾病中出现，而且表形往往在疾病发生一定时间后才出现，因此常不能及时的作出明确的诊断。研究发现各种表形的改变是由基因异常造成的，也就说基因改变是引起疾病的根本原因。基因诊断是病因的诊断，即特异又灵敏，可以揭示尚未出现症状时与疾病相关的基因状态，从而可以对表形正常的携带者及某种疾病的易感者作出诊断和预测，特别对确定有遗传疾病家族史的个体或产前的胎儿是否携带致病基因的检测具有指导意义。三、基因诊断的常用技术分子生物学技术是基因诊断的主要技术，近年来随着分子生物学技术日新月异，以核酸分子杂交和聚合酶链反应为核心发展起来了多种方法以被广泛用于基因诊断。（一）核酸分子杂交技术核酸分子杂交是指两条互补单链核酸（DNA或RNA）在一定条件下按碱基互补原则退火形成双链的过程，常用的核酸分子杂交技术有：1、Southern印记杂交（又称DNA印记）2、Northern印记杂交是一种研究RNA的方法3、斑点杂交4、原位杂交（二）DNA测序即DNA一级结构的测定，是现代分子生物学一项重要的技术。DNA测序能直观的反映出DNA序列的变化，因此是诊断未知突变基因最直接的方法。常用方法：1、双脱氧终止法测序的原理：DNA聚合酶利用单链DNA作为模板，准确合成互补DNA链，它不仅可以以单脱氧核苷酸为底物，而且可以以双脱氧核苷酸为底物，ddNTP若在合成过程中3’-末端掺入了ddNTP，DNA链的生长将会被终止，因此生成一系列不同长度的DNA片段。基本操作步骤：共设四个反应管，各管中同样加入DNA模板，DNA聚合酶放射性核素32P标记的引物，四种dNTP，将四种不同的ddNTP（ddATP、ddTTP、ddGTP、ddCTP),分别加入相应管进行温育，将四管反应产物平行加到同一变形凝胶上作电泳分离，通过放射自显影术可获得一系列全部以3’-末端ddNTP为终止碱基的长度不等的DNA片段的电泳谱带，通过电泳谱带可直接读出DNA的核苷酸顺序。2、化学降解法测序其原理是不同的碱基可被不同的化学试剂特异的修饰，使相应核苷酸变得不稳定，造成碱基的特异性切割，产生四组不同长度的DNA链的反应混合物，反应后经聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影也可读出DNA的序列。3、自动测序技术采用自动化测序仪进行，其原理同双脱氧链终止法，不同的是自动测序技术是用四种不同荧光染料分别标记ddNTP或标记引物，采用激光扫描器同步扫描，计算机进行阅读和编辑，电泳结束后结果以彩图和序列形式打印出来，自动序列技术结果清晰、准确、分辨率高。（三）聚合酶链反应近年来，基因分析和基因工程技术有了革命性的突破，这主要归功于聚合酶链反应(PCR)的发展和应用。应用PCR技术可以使特定的基因或DNA片段在短短的2－3小时内体外扩增数十万至百万倍。扩增的片段可以直接通过电泳观察，也可用于进一步的分析。这样少量的单拷贝基因不需通过同位素提高其敏感性来观察，而通过扩增至百万倍后直接观察到，而且原先需要一、二周才能作出的诊断可以缩短至数小时。聚合酶键反应原理聚合酶链反应(PCR)的本身是在同一试管内利用DNA聚合酶催化的反应反复进行同一段DNA片段的合成。聚合酶反应的模板是待检测核酸分子：DNA可直接用于反应，而RNA则需要用反转录酶反转录成为DNA，然后用作聚合酶反应的模板。反应的引物有两条，分别位于待扩增DNA片段的两端，可启动相对方向的DNA合成。这样从一个模板分子起始的话，经过n次聚合酶反应后就可以合成2n个模板分子。随着PCR技术的不断发展，根据被检测基因的性质和检测目的不同，在经典PCR技术的基础上派生出多种适用于各种场合和需求的PCR方法，多重PCR、不对称PCR、降落PCR、巢式引物PCR、锚定PCR、反向PCR、原位PCR、逆转录PCR、着色互补试验或荧光PCR、定量PCR和差别PCR。PCR反应特异性强,灵敏度高;极微量的DNA即可作为扩增的模板得到大量的扩增片段。毛发、血痕,甚至单