会计学传统(chuántǒng)的检测蛋白质相互作用的方法蛋白质的相互作用是生命活动的基础，一切生命活动几乎都是通过蛋白质之间的相互作用而实现的。在生物体发育的不同阶段，细胞分裂、分化的不同时期，都离不开蛋白质间的相互作用。近年，随着(suízhe)分子生物学技术的发展，人们对基因的结构和功能的认识不断加深，尤其是基因组研究的飞速进展，为揭示生命的奥秘提供了条件。然而，只凭借基因序列很难认识蛋白质的功能及在整个细胞中所处的位置和作用。由于蛋白质相互作用的复杂性，使得这方面的研究工作进展缓慢。最近兴起的双杂交系统为研究蛋白质的相互作用提供了一套崭新的方法。酵母(jiàomǔ)双杂交系统的基本原理Intheabsenceofbaitprotein,theAD/libraryfusionproteincannotbindtotheGAL4UASandthusdoesnotactivatetranscription.InteractionbetweenthebaitandlibraryproteinsinvivoaactivatestranscriptionofThereportergene.构建诱饵蛋白质粒(BD质粒)↓检查BD质粒单独是否能激活报告基因转录(如果不能，继续)↓文库质粒(AD质粒)转化带有BD质粒的酵母菌，铺SD/四缺平板↓挑his+、ade+双阳性克隆作β-galactosidase分析，消除假阳性↓β-gal分析阳性质粒在SD/四缺平板与摇管中传代，去除无效AD质粒↓传代阳性酵母质粒分离，转化大肠杆菌，获得大量阳性AD质粒↓检查AD质粒单独是否能激活报告基因转录(如果不能，继续)↓AD质粒转化带有BD质粒的酵母菌，再次验证其相互作用↓阳性AD质粒测序，按在酵母中读框方式进行蛋白同源性查询↙↘如果找到候选蛋白，克隆其如果找不到候选蛋白，有可能全基因，采用GST融合表达是新基因，可进一步分析，设技术(jìshù)和体外翻译技术(jìshù)在蛋白计引物，克隆全基因并进一步验证↓基因在真核细胞中的表达及定位分析图三双杂交系统文库筛选过程流程图双杂交系统是由Fields和Song于1989年提出的[1]。它的建立是基于对真核生物掉空转录起始过程的认识，细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与(cānyù)。转录激活因子，例如酵母转录因子Gal4，在结构上是组件式的（modular），往往由两个或两个以上结构上可以分开、功能上相互独立的结构域（domain）构成。其中有DNA结合结构域（DNAbondingdomain,DNA-BD）和转录激活结构域（activationdomain,DNA-AD〉。这两个结合域将它们分开时仍分别具有功能，但是不能激活转录，只有当两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才呈现完整的转录因子活性，并可激活上游激活序列（uostreamactivatingsequence,UAS）的下游启动子，使启动子下游基因得到转录。天然Gal4分子(fēnzǐ)由一条多肽链组成，含881个氨基酸。它有两个结构域：DNA结合域（DNA-bindingdomain,DB），由位于N-末端的1~147个氨基酸构成，能够识别位于Gal1基因的上游激活序列（upstreamactivatingsequence，UAS），此外，在其N-端还具有一段核定位序列；转录激活域（DNA-activating,AD），由位于C-末端的768~881位氨基酸构成。当Gal4的两个结构域位于不同肽链上，只要它们在空间上充分接近，则能够恢复Gal4作为转录因子的活性。Fields等以与调控SUC2基因有关的两个蛋白质Snf1和Snf2为模型设计了一个新的检测蛋白-蛋白相互作用的系统。将Snf1与DB融合，Snf4与AD融合，构建在穿梭质粒上。其中(qízhōng)，Snf1是一种依赖于丝氨酸、苏氨酸的蛋白激酶，Snf4是它的一个结合蛋白。研究者将两种穿梭质粒转化酵母GGY：171菌株，该菌株含有LacZ报告基因，并已去除相应转录因子基因。该实验的结果表明由Snf1和Snf4相互作用使得AD和BD在空间上接近，激活了报告基因LacZ的转录。图2普通双杂交系统(xìtǒng)的组成示意图双杂交系统(xìtǒng)的发展除了LacZ外，还利用了酵母的营养缺陷型，如Leu2和His3。此外，还发展了双报告基因系统。即未知蛋白Y与两个不同的AD融合，分别引起两个报告基因的转录。这样，实验结果的可靠性增大，敏感性增强。报告基因以多拷贝质粒的形式存在(cúnzài)，或整合入酵母基因组中。在MATCHMAKERTwo-HybridSysterm3中首次采用his3、ade2和lacZ三个