亲和的概念第一节生物素－亲和素免疫细胞化学技术二、几种经典的抗生物素－生物素染色法（一）亲和素-生物素-过氧化物酶（AvidinBiotin-peroxidaseComplex，ABC）技术2、操作步骤3、ABC法的优点（二）标记生物素-抗生物素技术（LabelledAvidin-BiotinTechnique,LAB技术）2、操作步骤2、操作步骤（四）BRAB（BridgedAvidin-Biotin）技术2、操作步骤（五）CSA（Catalyzedsignalamplification）法2、操作步骤（六）Envision技术2、操作步骤附免疫多染技术第二节葡萄球菌A蛋白（SPA）的应用葡萄球菌A蛋白（staphylococalproteinA，SPA）一、特性：1、多肽单链蛋白，对热和变性剂十分稳定；2、能与某些哺乳动物IgG的Fc段特异性结合；3、可以被各种标记物所结合，形成SPA标记物。三、常见问题及处理2、假阴性结果：原因有两种：（1）染色前错误：切片时选错蜡块和选错切片，这种情况可用H&E染色验证。（2）染色中错误：①确认是否忽略了应该加的某种试剂，包括一抗、二抗、三抗及底物等；②确认所有的试剂是否按正确的顺序加入，是否孵育了足够的时间；③对照抗体的标签确认是否使用了正确的抗体，以及所用的检测系统是否和一抗匹配，这一点是非常重要的；④检查抗体的有效期和保存条件，尤其是标记了酶或荧光素的抗体，要求在4~8℃条件下保存，应避免反复冻融，一定要避免与挥发性有机溶剂同放一室，以免降低抗体的效价；⑤检查抗体所使用的稀释度及稀释溶液是否合适；⑥确定标本的处理及储存条件；⑦检查色原/底物溶液，底物在制成工作液后应在一定时间内用完，否则会失效；⑧检查冲洗液是否和反应试剂匹配，溶液的pH值很重要，与过氧化物酶底物匹配的溶液中不应含有叠氮钠；⑨检查复染剂、脱水、透明和封片剂是否和所使用的色原匹配如：HRP用中性树胶，荧光素用水溶性封片剂，AEC等不能用二甲苯有机溶剂透明。三、杂信号（二）部分着色四、石蜡切片免疫组化染色步骤1.2HistogripTM：将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的Histogrip液中，停留1~2分钟，然后用双蒸水快速清洗三次，室温干燥或60oC烤箱烘烤一小时，装盒备用。1.3Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5分钟，60oC烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。2、常用酶消化：2.1胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%~0.1%，消化时间为37℃、10~40分钟，主要用于细胞内抗原的显示。2.2胃蛋白酶：一般使用浓度为0.4%，消化时间为37℃、30~180分钟，主要用于细胞间质抗原的显示，如：Laminin（层粘蛋白），CollagenIV（IV型胶原）等。2.3皂素（Saponin）：一般使用浓度为2~10mg/ml的saponin溶液，消化时间为室温孵育30分钟。3、抗原热修复：可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）效果最好。其pH值在6.00.1，如因蒸馏水本身造成的pH值偏差，请自行调整，常用方法如下：3.1石蜡切片微波炉抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，3％H2O2处理10分钟，蒸馏水洗2分钟×3。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92℃~98℃之间并持续10~15分钟（注意：无论是使用医用或家用微波炉，请根据具体机型酌情设置条件，务必满足以上步骤中对温度和时间的要求）。取出容器，室温冷却10~20分钟（注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型）。PBS洗，下接免疫组化染色步骤。3.2石蜡切片高压抗原修复操作方法：切片脱蜡至水。将1500ml~3000ml的枸橼酸盐缓冲液（工作液）注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时（约加热5~6分钟后），计时1~2分钟，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，取下气阀，打开锅盖，取出切片，蒸馏水洗后，PBS洗2分钟×3，下接免疫组化染色步骤。3.3石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸，从小容器的温度到达92℃~98℃起开始计时15~20分钟，然后端离电炉，室温冷却20~30分钟，蒸馏水冲洗，PBS洗，下接免疫组化染色步骤。五、冰