会计学1996完成(wánchéng)第一个真核生物--酿酒酵母全基因组测序。（一）酵母菌作为(zuòwéi)外源基因表达受体菌的特征如果说E.coli是外源基因最成熟的原核生物(shēngwù)表达系统，Yeast则是最成熟的真核生物(shēngwù)表达系统。酵母菌表达外源基因(jīyīn)的优势：表达(biǎodá)产物的糖基化位点和结构特点与高等真核生物有差距。（二）酵母菌的宿主(sùzhǔ)系统1、用作模式(móshì)真核生物的酵母宿主菌酿酒(niànɡjiǔ)酵母(Saccharomycescerevisiae)：巴斯德毕赤酵母(jiàomǔ)(Pichiapastoris)多形汉逊酵母(jiàomǔ)(Hansenulapolymorpha)乳酸克鲁维酵母(jiàomǔ)(Kluyveromyceslactis)非洲酒裂殖酵母(jiàomǔ)(Schizosaccharomycespombe)酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最详尽，但巴斯德毕赤酵母表达(biǎodá)外源基因最理想。3、提高外源蛋白(dànbái)表达产率的突变宿主菌4、抑制超糖基化的突变(tūbiàn)宿主菌抑制超糖基化的突变(tūbiàn)类型5、减少泛素依赖型蛋白降解的突变(tūbiàn)宿主菌酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码(biānmǎ)基因：泛素降解(jiànɡjiě)途径衰减的酿酒酵母UBA1缺陷(quēxiàn)型：UBC4-UBC5双突变型：（三）酵母菌的载体(zàitǐ)系统酿酒(niànɡjiǔ)酵母中的2环状质粒：含有多个单一酶切位点，便于(biànyú)克隆操作；YEp质粒：YRp质粒：YCp质粒：YAC质粒：YIp质粒：（四）酵母菌的转化(zhuǎnhuà)系统酵母菌的转化(zhuǎnhuà)方法原生质体转化(zhuǎnhuà)法原生质体转化(zhuǎnhuà)法的缺点：2）碱金属离子(lízǐ)介导转化法3）电击(diànjī)转化法转化质粒在酵母细胞(xìbāo)中的命运3）不含复制子的单链质粒进入细胞(xìbāo)后，能高效地同源整合入染色体，这对体内定点突变酵母基因组极有利。用于转化子筛选(shāixuǎn)的标记基因宿主菌：氨基酸或核苷酸生物(shēngwù)合成缺陷型突变如：LEU-、TRP-、HIS-、URA-显性标记基因编码产物(chǎnwù)主要是毒性物质的抗性蛋白。（五）酵母菌的表达(biǎodá)系统1、酿酒酵母(jiàomǔ)表达系统1）酿酒(niànɡjiǔ)酵母系统启动子甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(jīyīn)(GAPDH)磷酸甘油激酶基因(jīyīn)(PKG)乙醇脱氢酶基因(jīyīn)(ADH)②半乳糖激酶(jīméi)启动子(GAL1)半乳糖诱导GAL4高表达，不受GAL80产物(chǎnwù)抑制，激活GAL1、GAL7、GAL10等高效转录。PHO5启动子在培养基磷酸盐耗尽(hàojìn)时，启动转录；2）酵母菌对密码子的偏爱(piānài)性性结合因子：MF-酸性磷酸酯酶：PHO5蔗糖(zhètáng)酶：SUC2杀手毒素因子：KIL酿酒酵母(jiàomǔ)信号肽特点：MF-信号肽：对Thr/Ser的羟基(qiǎngjī)氧进行糖基化。O型糖链仅由甘露糖组成（哺乳动物细胞(xìbāo)的还含唾液酸基团）。5）酿酒(niànɡjiǔ)酵母表达系统的缺陷2、甲醇酵母表达(biǎodá)系统1）甲醇(jiǎchún)酵母与甲醇(jiǎchún)氧化酶启动子毕赤酵母/假丝酵母汉逊酵母醇氧化酶甲醇氧化酶alcoholoxidase,AOXmethanoloxidase,MOXAOX1、AOX2MOXAOX1占主导地位，负责(fùzé)AOX99%以上活性。甲醇(jiǎchún)氧化酶启动子：当甘油被消耗尽时，加入甲醇，诱导重组(zhònɡzǔ)蛋白的表达。优点(yōudiǎn)：实验室和工业操作(cāozuò)简单。不能满足结构要求(yāoqiú)严格的糖基化；3）甲醇酵母表达(biǎodá)系统操作原理宿主(sùzhǔ)菌株与标记基因二大宿主系统主要选择(xuǎnzé)标记毕赤酵母系统(xìtǒng)主要宿主菌Mut表型与甲醇(jiǎchún)利用率甲醇酵母系统(xìtǒng)的整合事件主要(zhǔyào)为单拷贝整合，1-10%为多拷贝整合。毕赤酵母系统(xìtǒng)模式表达载体①AOX1位点插入(chārù)②His4位点插入(chārù)③多基因插入事件（串联(chuànlián)整合）④基因(jīyīn)取代（GS115，AOX1+）甲醇酵母系统胞内表达(biǎodá)载体甲醇酵母系统胞内表达(biǎodá)载体甲醇酵母系统分泌(fēnmì)