蛋白质（II）蛋白质的共价结构肽键蛋白质是氨基酸通过脱水缩合形成肽键而形成的实验证据（1）蛋白质分子中游离的α-氨基，α-羧基很少。若水解，游离α-氨基，α-羧基以等mol数增加→说明α氨基，α-羧基参与某种结合，水解时，这种结合断开。（2）人工合成肽可以被蛋白酶水解O‖（3）包含-C-N-H基团的化合物如双缩脲H2N-CO-NH-NH2能与硫酸铜--氢氧化钠溶液产生双缩脲颜色反应。天然蛋白质也存同样反应。（4）人工合成的多聚AA的X射线衍射图案和红外吸收光谱与天然的纤维状蛋白质十分相似。（5）我国在世界上首次人工合成蛋白质-结晶牛胰岛素的成功，完全证明了蛋白质的肽链结构学说的正确性。肽键的特点酰胺键：由于酰胺氮上的孤对电子与相邻羰基的共振作用，表现出高稳定性C－N具40％双键性质C＝O具40％单键性质共振杂化体亚氨基（－NH－）pH0－14没有明显的解离和质子化倾向肽键是一个平面，称肽平面。可以有反式顺式结构，但旋转能障较高，反式稳定（Pro例外）蛋白质中的每一个氨基酸单位称氨基酸残基（residue）肽链结构的命名与书写根据含Aa的数目命名：**肽从NH2末端Aa残基开始，称为：某氨基酰某氨基酰某氨基酰…..氨基酸书写时氨基端在左边，羧基端在右边；以氨基酸的三字缩写或单字缩写代表对应的氨基酸；用短横线代表氨基酸残基之间的肽键肽的物理化学性质常见化学反应N端氨基酸残基与茚三酮、DNFB、PITC等反应C氨基酸残基成酯、成酰胺、成盐侧链氨基酸的反应磷酸化：Tyr、Ser、Thr酯化：Ser、Thr、Tyr糖基化：Ser、Thr、Cys双缩脲反应（Biuretreaction）：多肽与CuSO4碱性溶液反应，生成紫红色或蓝紫色的复合物，540nm处有最大光吸收。为肽和蛋白质特有（两个或两个以上肽键），氨基酸没有该反应。天然活性多肽蛋白质一级结构测定拆分蛋白质分子的多肽链测定多肽链的Aa组成分析多肽链的N末端和C末端残基断裂多肽链内的二硫键过甲酸氧化巯基化合物还原多肽链断裂成肽段酶解法化学法测定各个肽段的Aa顺序Edman降解法确定肽段在多肽链中的次序确定原多肽链中二硫键的位置多肽N末端分析方法二硝基氟苯（DNFBorFDNB法），Sange试剂丹磺酰氯（DNS）法原理：与DNFB相同优点：DNS具强烈的荧光，检测灵敏度可以达到110-9mol比DNFB法高100倍苯异硫氰酸酯（PITC）法氨肽酶法：氨肽酶：可以从多肽链的N端逐个降解氨基酸的肽链外切酶亮氨酸氨肽酶（LAP）：水解以Leu为N末端的肽键速度为最大多肽C末端分析方法肼解法蛋白质or多肽＋无水肼,C末端Aa以游离形式存在，其他Aa转变为相应的Aa酰肼化物加入苯甲醛可以使Aa酰肼化物转变成二苯基衍生物沉淀，C末端Aa则在溶液中。缺点：Gln、Asp、Cys破坏不易测出，Arg→Orn还原法：肽链C末端Aa+硼氢化锂－氨基醇羧肽酶法最有效，最常用的测C端殘基方法羧肽酶：专一地从肽链的C端逐个降解，释放出游离Aa肽链外切酶多肽链的部分断裂和肽段的拼接常用蛋白酶（内切酶）胰蛋白酶（Trypsin）：专一性强、只断裂Lys、Arg的羧基参与形成的肽键可以通过修饰增加或减少酶切位点糜蛋白酶（Chymotrypsin）专一性﹤胰蛋白酶，断裂Phe,Trp,Tyr等疏水芳香Aa的羧基所形成的肽键断裂键邻近的基团若为碱性：裂解能力↑，酸性：裂解能力↓嗜热菌蛋白酶（thermolysin）含Zn.Ca，Zn是活力必需的，Ca与热稳定有关专一性差，断裂较短的多肽链or大肽段最适PH8－9胃蛋白酶（Pepsin）专一性＝糜蛋白酶，要求被断裂键两侧的殘基都是疏水性Aa最适PH2，可用来确定二硫键的位置金黄色葡萄球菌蛋白酶（Glu蛋白酶）磷酸缓冲液PH7.8，能在Glu殘基和Asp殘基的羧基侧断裂肽键NH4HCO3缓冲液PH7.8，或醋酸铵缓冲液PH4.0中，只能断裂Glu殘基的羧基侧肽键梭状芽孢杆菌蛋白酶（Arg蛋白酶）专门裂解Arg殘基的COOH所形成的肽键，对不溶性蛋白质的长时间裂解很有效肽段的拼接次序确定利用不同的方法获得多种肽段组合断裂点位置差异越大越好断裂点不宜过多或过少确定N、C末端的Aa残基确定各个肽段的Aa顺序根据不同的肽段组合内Aa顺序的部分重叠，确定肽段的拼接次序二硫键的位置确定胃蛋白酶水解过甲酸打开二硫键双向电泳法分析。蛋白质的一级结构和生物功能的关系同源蛋白质的种属差异与生物进化基本概念：同源蛋白质：在不同的有机体中实现同一功能的蛋白质顺序同源：同源蛋白质的Aa顺序的相似性。不变残基：同源蛋白质Aa顺