实验一鲜叶蛋白提取及ＳＤＳ－PAGE电泳SDS-PAGE(十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)，简称SDS电泳。它不需要昂贵的仪器设备，操作简便，能在几小时内得到结果，有较高的重复性，且不要非常纯的样品（取决于样品的组成和对结果的要求），是目前为大家所接受的用于测定亚基分子质量的一种最好方法。这个方法可用于多肽分子量的分析，用于变性蛋白的分离以及仅仅溶解在粒子去污剂中的膜蛋白和用层析方法分离的蛋白和酶的纯化控制。1材料与试剂1.1材料茶树鲜叶(Camelliasinensis(L.)O.Kuntze.var.sinensiscultivarShuchazao)采自安徽农业大学试验茶园。1.2试剂丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺溶液（30.8%）：将300g丙烯酰胺和8g甲叉双丙烯酰胺溶解于去离子水中，最后用去离子水将体积定溶到1000ml。过滤后可在4℃保存两周。分离胶缓冲液：1.5mol/LTris-HCL,PH8.8(45.5gTris溶于200ml去离子水中，用浓HCl调节PH到8.8，最后用去离子水将体积补足到250ml。此溶液在4℃可保存两周。)浓缩胶缓冲液：0．5mol/LTris-HCL,pH6.8，(15.1gTris溶于200ml去离子水中，用浓HCl调节PH到6.8，最后用去离子水将体积补足到250ml。（此溶液在4℃可保存两周。)10Χ电极缓冲液（0.25mol/LTris，1.92mol/L甘氨酸，1%SDS）：15.1gTris，72.1g甘氨酸，5.0gSDS溶于500ml去离子水中，临用时稀释10倍。10%过硫酸铵溶液：1g过硫酸铵溶于10ml去离子水中，使用前现配现用。95%乙醇(在灌制分离胶后，用于封胶，使胶面平整)10%SDS：10gSDS溶于100ml去离子水中。10%低熔点琼脂糖溶液：0.5g低熔点琼脂糖溶于50ml电极缓冲液中。蛋白提取缓冲液（62.5mmol/LTris-HCLPH6.8,0.5%SDS,10%甘油和5%β-巯基乙醇）50ml上样缓冲液配方：0.5MTris-HCl(PH=6.8）:10ml,SDS:2g,溴酚蓝：0.1g,β-巯基乙醇:10ml2实验步骤2.1样品蛋白提取及定量方法一：采取Tris-丙酮法进行蛋白提取，方法如下：（1）取0.5ɡ鲜叶放入用液氮预冷的研钵中，加入适量液氮后迅速将其磨成粉末。（2）加入0.25ɡ水不溶性PVP，加入4倍鲜叶体积即2ml蛋白提取缓冲液充分研磨。（3）4℃下45min，后离心（4℃，15000g,15min）（4）取上清液加入2.5倍即5ml-20℃预冷的丙酮，-20℃下静置45min，之后同上离心，取沉淀在-20℃下静置挥去丙酮。（5）加入1ml上样液（12.5%，0.5mol/LTris-HCLPH6.8），沉淀充分溶解后，同上离心，取上清液即为待测蛋白溶液。方法二：取1～2g茶鲜叶加入等量PVPP和少量石英砂，液氮研磨，加入pH7.4的PBS缓冲液继续研磨直至匀浆，15000g、4℃离心15min，上清液即为粗酶液。粗酶液放于4℃冰箱中保存备用。蛋白定量采用G-250法（Bradford法）进行。2.2电泳2.2.1凝胶制备按表1用量制备12.5％分离胶和3.9％浓缩胶。过程：1分离胶配制：在80ml烧杯中按表1加入各种溶液，在加过硫酸铵和TEMED前，要对溶液进行超声脱气5min,后加入过硫酸铵和TEMED，摇匀，沿长玻璃板将胶加入两块玻璃板之间（小心不要产生气泡），加到距短玻璃板上緣3cm处，立即覆盖3-5mm95%乙醇，静止聚合约两个小时。胶聚合好的标志是胶与酒精之间形成清晰的界面。2将酒精倒去后再灌制按表1制好的浓缩胶。浓缩胶的配制过程同分离胶。3浓缩胶灌好后立即插入梳子，静置约四十分钟浓缩胶即可凝聚。凝好后，在电泳槽中加入电极缓冲液后拔出梳子。表112.5％分离胶和3.9％浓缩胶的成分及用量试剂12.5%分离胶3.9%浓缩胶(50ml)(10ml)超纯水15.9ml6.00ml30%Acr/Bis20.85ml1.32ml1.5mol/LTris-HCl(PH=8.8)12.5ml0.5mol/LTris-HCl(PH=6.8)2.52ml10%(w/v)SDS0.5ml0.1ml10%(w/v)过硫酸铵0.25ml0.1mlTEMED0.0165ml0.008ml注：=1\*GB3①TEMED：N,N,N,N-四甲(基)乙二胺=2\*GB3②在加过硫酸铵前，溶液应脱气。=3\*GB3③过硫酸铵和TEMED的量应根据室温和聚合情况而定。=4\*GB3④在灌制分离胶后立刻在胶面上滴上3-5mm95%乙醇，