衍射极限衍射极限荧光物质某种染料的光谱.图中蓝色曲线为激发光谱,红色曲线为发射光谱.620nm~850nm均有可能,670nm最大.这是自发辐射.STED的发明受激发射损耗的基本原理受激发射损耗的基本原理激发光可以使基态荧光粒子从基态跃迁到激发态,随后用损耗光(损耗光就是用来损耗荧光的光)照射样品,引起荧光物质的受激辐射,消耗了可以发射荧光的能级(荧光态)上的粒子数。受激辐射的作用是迫使粒子在它们被激发之后立刻回到基态,使焦斑上那些受到损耗的荧光分子失去发射荧光光子的能力,而剩下的可发射荧光区被限制在小于衍射极限区域内,于是获得了一个小于衍射极限的发光点.激发光将基态粒子激发到激发态后,向下跃迁的几率K=σ×I.其中σ是分子的吸收截面,I是损耗光的光强.损耗光的光强越大,损耗的荧光分子越多通过损耗后,外围的荧光被强烈地损耗而留下中心的荧光,但是边缘仍会有残留荧光,可以通过改变入射光波的波前分布来模糊边缘的荧光.荧光的产生是自发辐射,处于激发态被损耗光照射后是受激辐射,受激辐射发出的光子与吸收的光子相同,选择合适的波长的损耗光就可以使激发态的染料发出特定波长的光(激光的原理).损耗光的波长要选在荧光发射谱的红边,以避免重激发,激发光与损耗光的时间差要选的合适,既保证有荧光产生,又能保证一定的损耗几率.STED荧光显微镜示意图环形的损耗光是利用一个位相片进行光位相调制，最终在焦点处形成环形光分布。按顺序先给激发脉冲(2ps左右)，等荧光物质跃迁上去了,马上给一个受激辐射波长的脉冲（250ps左右），用二向色镜区分受激辐射跟自发辐射，探测过来的自发辐射信号,移动样本就可以三维成像.起初的主要用于突破STEM显微镜主要用于突破横向衍射极限,横向分辨率可达70nm,而轴向分辨率还较低,因为有限的孔径角导致轴向分辨率降低.近来将和4pi显微术互补性地结合,在技术上扩大了有效孔径角.目前已经获得了100nm的轴向分辨率.4pi显微术简介缺点1.需要强光,能量利用率低.2.过强的光还会引起光致漂白.3.略贵4.应用范围较窄受激损耗的原理也可以应用在其它地方,比如近年来在纳米光刻领域引起重点关注的双光束刻录技术.