生物化学实验河南工业大学生物工程学院生物技术系2015.3实验内容教学目的学习方法实验室守则实验一淀粉含量测定三、实验仪器和试剂四、实验步骤六、思考题样品加盐酸处理时，煮沸时间少于或多于15min会对测定结果产生什么影响？实验二氨基酸的纸上层析三、仪器和试剂四、实验步骤1．计算出各种氨基酸的Rf值，并根据Rf值鉴定出混合氨基酸中的各组分，在层析图谱上标出各氨基酸名称。2．对氨基酸移动快慢的原因给予简要分析。实验三蛋白质分子量测定三、仪器和试剂四、实验步骤五、结果计算五、注意事项1．30%Acr-Bis是神经毒化合物，操作时要小心，做好个人防护2．过硫酸铵需现用现配3．过硫酸铵和TEMED在灌胶前加入即可4．用微量加样器上样时，勿刺破胶面实验四淀粉酶活力测定其反应如右图：三、仪器和试剂四、操作步骤五、结果计算六、附注七、思考题实验五蛋白质含量的测定二、实验原理三、实验试剂、器材四、操作步骤C：标准盐酸溶液摩尔浓度(0.01)。V1：滴定样品用去的盐酸溶液平均毫升数。V0：滴定空白消化液用去的盐酸溶液平均毫升数。W：样品重量（mg）。14.01：氮的原子量。K=5.7M=12.5%V2=100mLV3=5mL实验六甲醛滴定测氨基氮三、实验仪器、试剂及材料氨基酸为两性离子，在水溶液中有下列平衡：RCHCOO-+2HCHO＝RCHCOO-+H+↓↓NH3+N(CH2OH)2常温下甲醛能迅速与氨基酸的氨基结合生成亚羟甲基化合物，使上述平衡右移促使NH3+释放H+，从而使溶液酸度增加，滴定终点移至酚酞的变色域内（pH值9.0左右），根据滴定终点时所消耗标准碱的量即可算出反应体系中存在的游离氨基即氨基氮的含量如果样品为一种已知的氨基酸，即可算出该氨基酸的含量。如果样品为未知氨基酸或几种氨基酸的混合物，则只能算出其氨基氮的含量。四、操作方法五、结果处理与计算说明：1.本法优点是简单快速，缺点是不够准确，其准确度仅达到氨基酸或氨基氮理论含量的90％。而且，如果样品液中含有脯氨酸或酪氨酸时滴定误差更大，因为脯氨酸与甲醛作用后生成不稳定化合物使结果偏低，酪氨酸的酚基结构又使结果偏高。2．甲醛滴定法常用以测定蛋白质的水解程度。3．中性甲醛需临用前配制。放置一段时间后，在使用前需重新中和。六、思考题实验七酵母RNA的提取、组分鉴定和含量测定二、实验原理三、仪器和试剂（13）苔黑酚(3,5-二羟基甲苯)乙醇溶液（14）地衣酚-铜离子试剂2、器材：（1）离心机（2）分光光度计（3）抽滤装置。（4）电子天平四、实验步骤2.RNA含量测定（1）标准曲线的制作：（每4组8人做1标准曲线）（2）样品的处理：称取10mg粗提的酵母RNA加入10mL0.04MNaOH溶解后转移至100mL容量瓶中加水定容混匀即得样品液.（3）酵母RNA含量测定：取试管1支加入2mL样品液，再加2mL地衣酚-铜试剂沸水加热25分钟冷却后测定A(用1号调零)3、酵母RNA水解取100mg粗提的酵母RNA于三角瓶中，加入1.5M硫酸10mL,沸水浴加热10分钟制成水解液，然后进行组份鉴定。4、RNA组份鉴定（1）嘌呤碱：取水解液1mL于试管中滴加入2mL浓氨水。然后加入10滴0.1M硝酸银溶液，观察有无白色嘌呤碱银化合物沉淀。（2）核糖：取水解液1mL于试管中加入三氯化铁浓盐酸溶液2mL和苔黑酚乙醇溶液4滴。放沸水浴中10min。注意观察核糖是否变成绿色。（3）磷酸：取水解液3mL于试管中加5滴浓硝酸酸化，再加入20滴钼酸铵溶液在沸水浴上加热，观察有无黄色磷钼酸铵沉淀产生。四、结果处理1.酵母RNA得率（%）=（W2-W1）*100∕W其中W-干酵母粉重量（克）2.粗提的酵母RNA含量（%）=m*V1*100∕V2*W/其中W/-酵母RNA重量（µg）m-从标准曲线上查得RNA的微克数V1-100mLV2-2mL实验八赖氨酸含量测定二、实验原理三、实验仪器、试剂四、实验步骤2、样品的处理与测定：在电子天平上称取小麦粉10mg于具塞试管底部→加1mL2%碳酸钠于80℃水浴中保温提取10min→加2mL茚三铜试剂80℃水浴中保温30min后冷却至室温→加5mL95%乙醇和5mL蒸馏水充分混匀后转移至离心管中3000转/分离心3min（离心前必须平衡）→取上清液测A515（用1#管调零)五、结果计算实验九、凝胶层析法分离蛋白质二、实验原理凝胶层析又称分子筛层析，是利用有一定孔径范围的多孔凝胶，对混合物中各组分按分子大小进行分离的层析技术。把含有不同大小分子的混合液，铺加在胶面上，让它流过凝胶柱。由于凝胶具有网络结构，当混合液通过凝胶颗粒缝隙中时，溶液中的溶质凡是比网孔小的分子，都能自