目的要求实验原理有机溶剂分级沉淀是分离蛋白质的常用方法之一。有机溶剂能使许多溶于水的生物大分子发生沉淀，其主要作用是降低水溶液的介电常数。溶液的介电常数降低意味着溶质分子间异性电荷库仑引力增加，从而使溶质的溶解度降低。同时有机溶剂溶于水，对大分子物质表面的水化膜具有破坏作用，最后使这些大分子脱水而互相聚集析出。进行有机溶剂沉淀时，欲使原溶液中有机溶剂达到一定浓度，需加入有机溶剂的浓度和体积可按下式计算：V－需加100％有机溶剂的体积V0－原溶液的体积；S1－原溶液中有机溶剂的浓度；S2－要求达到的有机溶剂浓度；100－指加入的有机溶剂浓度为100％。采用有机溶剂沉淀法本实验采用有机溶剂沉淀法从肝匀浆中分离纯化碱性磷酸酶(简称AKP)。先用低浓度醋酸钠(低渗破膜作用)制备肝匀浆。醋酸镁则有保护和稳定AKP的作用。匀浆中加入正丁醇可使部分杂蛋白变性，释出膜中酶，过滤后，以去除杂蛋白。操作步骤以下操作均在4~10℃进行。5.丙酮沉淀向上述剩余悬液中逐滴加入冷丙酮，使丙酮终浓度达33％，混匀后离心2min(8000r/min)，弃沉淀。量取上清液体积后，缓缓加入冷丙酮，使丙酮终浓度达50％，混匀后立即离心10min(8000r/min)，弃上清液。向此沉淀中加入5.0mLTrispH8.8缓冲液，使沉淀溶解，再离心5min(8000r/min)，将上清液倒入试管中，记录体积、弃去沉淀。上清液即为部分纯化的碱性磷酸酶液，此为D液。吸取D液0.1m1置于编号为DE的试管中，供测酶活性用。吸取D液0.1m1置于编号为Dp的试管中，供测蛋白质浓度。(二)碱性磷酸酶的比活性测定其中碱性磷酸酶活性用磷酸苯二钠法测定，即以磷酸苯二钠为底物，被碱性磷酸酶水解后产生游离酚和磷酸盐，酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化，可生成红色的醌衍生物，根据红色的深浅就可测定酚的含量，从而计算出酶的活性大小。酶活性单位表示：在37℃下保温15分钟产生1μg酶者为1个酶活性单位(2)酶活性单位计算分离阶段蛋白质酶活性比活性纯化倍数得率(mg/ml)（U/ml）(U/mg)Summaryofporcineplatelet-derivedgrowthfactorpurificationprotocol（1）有机溶剂沉淀是个放热过程，所以要在低温下进行。溶剂应预冷，加入时要边搅拌边滴加，以避免局部浓度过高使酶蛋白变性。（2）分清实验过程中每次离心后保留的是上清液，还是沉淀。（3）比色应在显色1h内完成。